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研究背景:生物钟是机体内在的、周期约为24h的“时钟”,调节生物体内的各组织和器官的生理、代谢和行为,使机体内的各种生理活动在昼夜交替变化中呈现出周期性规律,而生物体内的这种节律振荡行为被认为是机体最显著的生命活动特征之一。近年来多项研究显示蛋白质泛素化修饰在生物钟蛋白水平的周期性振荡中发挥着重要的作用。转录因子BMAL1是生物钟的核心蛋白,关于BMAL1泛素化修饰调控生物节律的研究较少,且机制不清。因此,本论文将利用定量蛋白组学技术筛选和寻找调控BMAL1和生物节律的泛素连接酶,并通过一系列生化实验阐明其作用的分子机制,探索泛素连接酶对生物节律的调控。研究方法:首先,我们利用免疫沉淀纯化生物钟核心蛋白BMAL1及其相互作用蛋白,并利用蛋白质组学方法鉴定BMAL1的相互作用蛋白,通过非标记定量分析质谱数据发现可能与BMAL1存在相互作用的E3泛素连接酶。然后,通过免疫沉淀和免疫印迹方法验证BMAL1与E3泛素连接酶UBR5的相互作用,并利用免疫荧光共定位实验分析其与BMAL1在细胞内的定位情况。接着,我们通过siRNA敲低、CRISPR/Cas9敲除和过表达等方法研究UBR5对BMAL1的调控,使用放线菌酮(CHX)、蛋白酶体抑制剂(MG132),结合免疫沉淀和免疫印迹等实验方法,研究UBR5对BMAL1的蛋白水平、稳定性和泛素化修饰水平的调控。之后,我们进一步通过双荧光素酶报告基因检测系统探究UBR5对BMALI转录活性的调控。最后,我们在果蝇中利用RNA干扰技术和行为学实验研究敲低UBR5同源基因hyd后对果蝇生物节律的影响。研究结果:通过免疫沉淀与蛋白质组学方法发现可能与BMAL1相互作用的E3泛素连接酶UBR5;通过正向、反向纯化、内源性蛋白纯化证实UBR5和BMAL1的相互作用;免疫荧光共定位技术发现BMAL1与UBR5在细胞核共定位。siRNA敲低和CRISPR/Cas9敲除UBR5明显增加BMAL1蛋白水平;而过表达UBR5显著下调BMAL1蛋白水平;蛋白酶体抑制剂MG132抑制UBR5对BMAL1的下调;过表达UBR5会增加BMAL1的泛素化修饰水平,且该修饰为K48位多聚泛素链,说明UBR5通过泛素-蛋白酶体途径调控BMAL1的稳定性。双荧光素酶报告基因实验说明UBR5能够明显下调BMAL1下游基因Rev-Erbα转录水平,证实UBR5影响BMAL1的转录活性。在果蝇体内敲低UBR5同源基因hyd会明显缩短生物节律周期。研究结论:我们的研究发现泛素连接酶UBR5与生物钟核心蛋白BMAL1相互作用,并通过调控BMAL1的泛素-蛋白酶体途径降解而降低BMAL1的稳定性和蛋白水平,影响其转录活性,进而调控果蝇的生物节律周期。本论文阐明了泛素连接酶UBR5通过调控BMAL1稳定性和转录功能进而影响生物节律的分子机制。