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目的:缺血性心血管疾病是目前严重威胁人类健康的疾病之一,其发病率和死亡率逐年增加。动脉血栓形成是心血管疾病的病理基础,血管血栓引起的缺血会导致组织缺氧,在ROS丰富的环境中血小板ERK5表达上调,促进血小板活化,使血小板大规模聚集,导致血管堵塞,形成血栓,加重心肌梗死,血小板ERK5可能作为一种氧化还原传感器,加速急性心肌梗死后梗死面积扩大。线粒体是ROS产生的主要来源,并发挥着增强血小板激活的中心作用。心力衰竭患者的血小板ROS增加,线粒体功能障碍和凋亡激活,诱导血小板异常活化,线粒体可作为抗血小板的潜在靶点。活血化瘀中药凭借其多靶点多途径的优势成为抗血小板的基础用药,川芎和丹参是活血化瘀中成药最常用的两位中药,川芎嗪和丹参素分别为其主要活性成分,研究显示川芎嗪和丹参素均有抗血小板抗血栓的作用,但其作用机制尚不明确。本研究探讨川芎嗪及丹参素抗血小板抗血栓的作用及分子机制,为川芎嗪和丹参素临床应用提供理论和实验依据。方法:1.建立氯化铁诱导的颈总动脉血栓模型,通过检测血栓湿重,HE染色观察血管内血栓生成状况,检测川芎嗪、丹参素对血栓形成的抑制作用;采用微孔法检测血小板在二磷酸腺苷(Adenosine diphosphate,ADP)、U46619、TRAP-6诱导下的聚集率,在纤维蛋白原上的铺展检测血小板的粘附作用,流式细胞术检测血小板P-选择素(Cluster of differentiation62 platelet,CD62p)的表达,明确川芎嗪、丹参素对血小板活化的抑制作用。2.采用CM-H2DCFDA染色检测血小板ROS的释放,蛋白免疫印迹(Western blotting,WB)法检测ERK5、P70S6K、Rac1的磷酸化蛋白表达量,明确川芎嗪调控缺氧血小板活化的作用机制;WB法检测沉默信息调节因子1(Silent information regulator1,SIRT1)、DC-SIGN蛋白表达量,CM-H2DCFDA染色检测血小板ROS的释放,利用线粒体DNA提取试剂盒分离mt DNA,Nanodrop检测DNA含量,明确丹参素抗血小板活化的作用机制。结果:1.川芎嗪可抑制ADP、U46619、TRAP-6诱导的血小板聚集,抑制缺氧诱导的血小板在纤维蛋白原上的粘附,CD62p的释放,表明川芎嗪可抑制血小板活化,通过检测川芎嗪对氯化铁诱导的动脉血栓形成的影响,证明其可抑制血栓形成;丹参素可抑制ADP、U46619、TRAP-6诱导的血小板聚集,抑制ADP诱导的血小板在纤维蛋白原上的粘附,CD62p的释放,表明丹参素可抑制血小板的活化,通过检测丹参素对氯化铁诱导的动脉血栓形成的影响,证明其可抑制血栓形成且不引起出血反应。2.川芎嗪抑制血小板ROS的积聚,下调ERK5、P70S6K、Rac1的磷酸化蛋白表达,川芎嗪可能通过调节ERK5信号通路发挥抑制血小板活化作用,进而抑制血栓形成;丹参素可上调SIRT1蛋白的表达,抑制ROS的积聚,下调DC-SIGN蛋白的表达,线粒体DNA含量检测显示丹参素抑制血小板线粒体DNA的释放,提示丹参素通过调节线粒体功能发挥抑制血小板活化的作用。结论:1.川芎嗪可通过抑制ERK5/P70S6K/Rac1通路蛋白表达,发挥抗血小板抗血栓的作用。2.丹参素可通过上调SIRT1蛋白的表达,抑制ROS积累及血小板线粒体DNA的释放,上调DC-SIGN蛋白的表达,发挥抗血小板的作用,抑制血小板活化,进而抑制血栓形成且不引起出血。