目的帕金森病(Parkinson disease,PD)是渐行性神经退行性疾病,表现为黑质纹状体中多巴胺能神经元的进行性死亡,神经元胞浆内包涵体Lewy小体增多。PD的病因至今仍未完全明确,但公认的机制有兴奋性毒性和能量代谢紊乱、氧化应激、线粒体活性下降等功能紊乱。环境因素比如杀虫剂和其他因素也可以诱发散发性PD,而散发性PD占全部病例了90%以上。最近研究表明,PD疾病的发生与内质网应激和泛素-蛋白酶体系统有关。本课题结合国际帕金森病研究的最新进展和动态,采用腹腔注射MPTP诱导模拟人的PD慢性病程的动物模型,研究内质网应激与泛素-蛋白酶体系统与帕金森病发病的关系；同时进行天然中药新药安颤灵的药效学作用机理研究,为其进一步中药新药开发提供科学依据。方法1.动物实验：(1)建立PD模型及实验分组：选取健康雄性c57BL/5J小鼠60只(9周龄),随机分成5组,分别为PD模型组12只,予小鼠腹腔体内注射MPTP(30mg/kg.d),同时蒸溜水灌胃与安颤灵组等体积。正常对照组12只,蒸溜水灌胃与模型组相同,腹腔注射改为相同体积的生理盐水(30mg/kg.d)。安颤灵组(分高、中、低剂量组),每组各12只,该组在模型组基础上将灌胃的蒸溜水改为以上不同剂量的中药煎液。(2)动物行为学观察：注射后7d、14d和21d按0.25mg/kg腹腔注射阿扑吗啡,观察旋转行为的变化,共记录30mi n取平均值。同时注意观察小鼠震颤、活动迟缓、抓握、嗅探等异常行为。(3)黑质区TH、GFAP.OX-42免疫组化检测：注射后第21天,在2.5%戊巴比妥钠麻醉下,从左心室插管灌注4%多聚甲醛,之后断头取脑,经系列生化固定后。自近黑质部位起连续冠状切片,挑取对称的黑质区切片。行TH、GFAP、OX-42免疫组织化学染色,观察中脑黑质酪氨酸羟化酶(TH)阳性细胞,星形胶质细胞(GFAP)及小胶质细胞(OX-42)的变化,以了解DA能神经元损毁情况以及是否选择性地损毁多巴胺能神经元以及小胶质细胞的激活。切片再经系列生化免疫标记,置显微镜观察,计数阳性细胞数。(4)a-synuelein、Parkin和泛素(ubiquitin)的免疫组化检测：通过免疫组织化学染色法观察DA能神经元lewy小体的主要成分a-共核蛋白(a-synuelein)、Parkin和泛素(ubiquitin)的表达。切片经系列生化免疫标记后,显微镜观察,显微图象分析检测。模型组、正常组、安颤灵组处理时间和剂量完全相同。(5)RT-PCR检测黑质区组织Caspase-12mRNA的表达：GenBank检索小鼠Caspase-12序列,自行设计引物,由上海Sangon公司合成。Caspase-12引物(506bp)上游：5’-AGGCAACTCTCATGCAGTTC-3’(1319-1338bp),下游：5’-AACCATGTATGCCA GAG AC C-3’(1847-1866bp)。取总RNA4ul,加入Olig (dT)1ul,65℃15min,立即置冰上；加入10XRT缓冲液2μl,dNTP2ul,25mmol/L MgC122μl,RNA酶抑制剂1μl,A-MV1μl,加DEPC处理水至总体积20μl,42℃60min逆转录；取逆转录产物cDNA4μl,加入10%PCR缓冲液5μl,dNTP1μl, Caspase-12上游、下游引物各2μl(20pmol),Taq酶(5U/μl)0.25μ l,25mmol/LMgC123μl,加无菌双蒸水至总体积50μl。PCR条件：94℃5min,94℃40s,55℃40s,72℃90s,35个循环；72℃10min。取PCR扩增产物10μl行琼脂糖凝胶电泳,经凝胶成像系统扫描Caspase-12灰度值.。比较各组黑质区组织Caspase-12mRNA的表达。(6)Western blot检测黑质区组织Caspase-12, CHOP、Bip/GRP78蛋白的表达：50mg小鼠黑质组织用1%TritonX-100加蛋白酶抑制剂裂解,用牛血清白蛋白方法检测蛋白含量。每一样品取总蛋白30ug上样,用12%不连续聚丙烯酞胺凝胶电泳,转蛋白至硝酸纤维素膜；5%脱脂奶粉封闭2h；加进入Caspase-12、CHOP、Bip/GRP78第一抗体轻摇2h后4℃过夜；Tris磷酸盐缓冲液洗膜15min,共3次；加人辣根过氧化物酶标记的第二抗体37℃1h,Tris磷酸盐缓冲液洗膜15min,共3次。化学发光试剂作用后X胶片曝光,经显影、定影等处理后观察结果。用凝胶成像系统扫描图像,对其灰度分析,比较各组黑质区组织Caspase-12, Bip/GRP78蛋白的表达。(7)数据统计：数据统计采用均值(x)±标准差(s),采用SAS软件包行单因素方差分析检验,以P<0.05表示有显著性差异。2.离体实验：安颤灵对H2O2诱导PC12细胞凋亡及内质网应激的影响(1)细胞株及培养体系：Pc12细胞是小鼠肾上腺嗜铬细胞瘤细胞株,由中国科学院上海细胞生物学研究所提供。细胞接种在预先铺过鼠尾胶的培养皿中,用含有10%胎牛血清和10%马血清的DMEM培养基(美国Gibco BRL公司),同时加入2mmol/L谷氨酰胺、100u/ml链霉素和100u/ml青霉素,在温度37℃、5%CO2、饱和湿度的cO2培养箱中培养。隔天传代细胞1次,实验所用的细胞均处于对数生长期,且存活细胞百分率均在95%以上(台盼兰拒染法)。(2)实验分组和处理：在24孔培养板上,按每孔1．25×105个细胞的浓度加入Pc12,在DMEM中培养4h后,加入高、中、底不同浓度的安颤灵含药血清(50,100,200ug/ml)预处理3d,然后将细胞暴露与200mMH2O2中。经12h共同培养后,测定细胞的凋亡／死亡和存活情况。设正常和模型对照,实验重复3次。(3)PC12细胞DNA倍体的分析：在100μl样本液中加人含50mg/L碘化丙啶(美国BD公司)和50mg/L核糖核酸酶A(上海生工生物工程公司)的染液500μl,避光37℃孵育30min,流式细胞仪采集数据进行亚二倍体峰(subGl)的百分比分析。每份标本利用CellQuestTM软件分析10000个细胞,结果用百分比表示。(4)凋亡细胞染色和荧光观察：弃去介质和处理因素,用1×D-PBS轻轻清洗细胞一次。直接在细胞上添加适当量(约在24孔培养板上按50uL/孔,在12孔培养板上按100uL/孔或6孔培养板上按150uL/孔)的联合染液(2mM Calcein AM和4mM Ethidium Homodimer-1),在室温下孵育30分钟。标记的存活和死亡细胞用荧光显微系统(Zeiss Axiovert135M, Mercury Lamp, Carl Zeis HBO100W/Z),以485nm和590nm立即观察和拍照。结果1.动物实验结果：1.1造模及行为学结果：腹腔注射MPTP后,PD模型组小鼠于第1次注药后10-20min均出现不同程度的震颤、竖毛、翘尾,上述症状持续4-5h后逐渐减轻,但仍有活动减少,动作迟缓等变化。治疗前模型组和安颤灵组组间的旋转圈数无显著性差异(P>0.05)。治疗后,实验第7天、第14天和第21天安颤灵组小鼠旋转次数逐渐减少,分别与模型组相比,差异显著(P<0.05、P<0.01、P<0.01)。悬挂行为结果显示：实验前1天(即首次注射MPTP前1天)观察小鼠悬挂行为,模型组、安颤灵组小鼠评分分别与对照组相比,无差异(P>0.05、P>0.05)；实验第7天、第14天和第21天观察模型组小鼠悬挂行为,其评分明显降低,分别与对照组相比,差异显著(P<0.01、P<0.05)；实验第14天和第21天安颤灵组小鼠悬挂实验评分明显升高,分别与模型组相比,差异显著(P<0.01、P<0.01)。实验前1天观察小鼠爬杆行为,模型组、安颤灵组小鼠评分分别与对照组相比,无差异(P>0.05、P>0.05)。注射MPTP第7天、第14天和第21天观察模型组小鼠爬杆行为,其评分明显降低,分别与对照组相比,差异显著(P<0.01、P<0.05、),提示造模成功。实验第14天和第21天安颤灵组评分明显升高,分别与模型组相比,差异显著(P<0.05、P<0.05)。1.2.免疫组化、RT-PCR、Westernblot检测结果：1.2.1免疫组化结果：PD模型组小鼠黑质区TH表达显著降低(P<0.01),GFAP、OX-42表达增多。经安颤灵灌胃处理的各组小鼠TH较模型组增多(P<0.01),而GFAP、OX-42阳性细胞数无明显变化。与模型组相比,中药安颤灵组a-synuclein.Parkin、ubiquitin阳性细胞数均减少(P<0.01)。1.2.2RT-PCR结果提示,腹腔注射MPTP可诱导小鼠脑黑质区神经元的内质网应激反应,而安颤灵对这一应激反应有一定的缓解作用。1.2.3.Western blot检测结果显示：模型组小鼠黑质区Caspase-12、CHOP蛋白表达水平较正常对照组显著上调(P<0.01),提示黑质区神经元的内质网应激反应提高。安颤灵组Caspase-12、CHOP蛋白表达水平较模型组明显降低(P<0.05)。模型组小鼠黑质区组织GRP78/Bip蛋白的表达较正常对照组上调,安颤灵组GRP78/Bip蛋白的表达较模型组进一步上调(P<0.05)。2.离体实验结果：实验光镜下观察发现,对照组PC12细胞排列整齐,贴壁生长旺盛,形态规则,呈长梭形或长棱形,有长短不等的类似神经轴突的伪足,交织成网状。H2O2损伤后的模型组细胞,排列紊乱,贴壁不牢,伪足缩短火消失,大量细胞悬浮,碎裂,死亡。安颤灵含药血清培养细胞变化较模型组明显减弱。细胞排列尚整齐,悬浮细胞较少,可见明显伪足。与大、小剂量组相比,中剂量组细胞的存活率显著升高(P<0.01)；与正常组相比,模型组细胞凋亡指数明显增加(P<0.01),a-synuclein、阳性细胞数亦均增多,而TH阳性细胞明显减少；与H2O2组相比,安颤灵组细胞凋亡指数明显降低,a-synuclein阳性细胞数均减少,TH阳性细胞明显增加(P<0.01)。H2O2模型组PC12细胞与正常对照组相比细胞周期明显左移。在细胞G1/Go期前有明显的亚二倍体峰(subGl-Go),处于此期的细胞比率为(94.50±21.3)%,而正常对照组处于此期的细胞比率为(1.36±2.0)%。而且H2O2模型组G1/G0期及所占的比率明显低于正常对照组,G2期及M期的细胞所占的比例也减少,在细胞周期图中代表这两期的峰几乎不可见。而同时给予不同浓度安颤灵含药血清(2.5%、5%、10%)孵育后,Pc12细胞subG1-Go百分比分别为(82.90±12.6)%、(69.34±15.7)%、(51.63±6.8)%。结论中药安颤灵小鼠行为学表明,采用MPTP注射法,造模成功；安颤灵能提高肢体运动协调能力,对MPTP诱导所致的PD模型小鼠PD运动体征具有明显的改善作用。ESR和UPS可能是PD多巴胺能神经元凋亡的关键因素,内质网应激的早期调节过程就存有泛素-蛋白酶体系统对异常蛋白的降解活动。ERS和UPS有相互促进作用,以达到内质网蛋白合成与降解的动态平衡,保证内环境的稳定。中药安颤灵就是通过黑质区组织Caspase-12mRNA的表达和Caspase-12, CHOP、Bip-GRP78蛋白的表达靶点的干预来实现对内质网应激反应(ESR)影响和改善,减少细胞毒性蛋白的合成。通过a-synuelein.和泛素(ubiquitin)蛋白的表达靶点的干预来实现对UPS的影响和改善,提高发现和破坏这些装配和折叠错误的蛋白的能力,使它们及时降解,消除细胞毒性蛋白,达到改善保护黑质区DA能神经元神经细胞,减少细胞凋亡。同时,对H202诱导的神经元ERS与凋亡反应具有显著地拮抗作用,从而达到保护细胞的作用。提示,H2O2能诱导细胞凋亡,而安颤灵可抑制这一细胞凋亡过程。腹腔注射MPTP可诱导c57小鼠黑质区神经元的内ESR,而安颤灵对这一应激反应具有明显拮抗作用,且该作用在一定浓度范围内呈现剂量依赖性。安颤灵可抑制PD小鼠模型黑质细胞的凋亡,并可改善UPS的功能。表明细胞内质网生成的毒性蛋白质a-synuclein.减少,毒性蛋白质的泛素降解通路正常或提高。表明ERS功能受到保护干预和UPS的功能活性良好。提示安颤灵可抑制PD小鼠模型黑质细胞的凋亡,可保护和改善ERS及UPS的功能。