论文部分内容阅读
酒精性肝病（Alcoholic liver disease,ALD）是一种伴有炎症和肝细胞死亡复杂的病理过程,严重会逐渐发展为肝硬化或肝癌。目前,治疗ALD的手段及方法仍有很大的局限性,水飞蓟素等药物治疗具有明显的副作用。因此,寻找低毒、高效治疗ALD的药物已成为国内外的研究热点。研究表明,肠道菌群与ALD有着密切的联系,天然产物多糖能够通过调节肠道菌群的组成参与对ALD的调控。雷公菌（Nostoc Commune Vauch.）属蓝藻纲念珠藻,在我国广泛分布,富含多糖、蛋白质,维生素,碳水化合物等成分。与此同时现有报道证明雷公菌多糖具有抗肿瘤、抗氧化等生物活性,但有关其对肝脏保护作用未见报道。本研究以雷公菌为材料,利用水提醇沉提取法制备雷公菌多糖（NCVP）并对其进行理化性质鉴定;通过体外实验证明NCVP在细胞水平上对乙醇诱导的L02细胞损伤具有保护作用;通过建立小鼠急性ALD模型,探讨NCVP对急性ALD的保护作用;16s r RNA测序技术分析NCVP对ALD小鼠肠道菌群组成的影响,为探明NCVP的对酒精性肝损伤的保护作用及潜在机制提供理论参考。主要研究内容及结果如下:（1）利用水提醇沉法获得雷公菌多糖（NCVP）,计算其得率约为6.5%。理化性质分析结果表明,NCVP的总糖含量约为84.4%,还原糖含量约为2.6%,总蛋白含量约为0.5%,糖醛酸含量约为11.0%,硫酸基含量约为21.9%。红外光谱分析表明NCVP可能是一种通过α-糖苷键连接且具有吡喃糖环的水溶性多糖;NCVP的相对分子量为501.27 k Da;单糖成分分析结果表明,NCVP主要由葡萄糖、半乳糖、木糖、葡萄糖醛酸以及甘露糖组成。（2）利用L02细胞建立酒精性肝损伤模型,检测NCVP对L02细胞的保护作用。结果表明NCVP对L02细胞无毒性,且对酒精诱导的L02细胞损伤具有保护作用,并呈剂量依赖性;NCVP能够提高酒精损伤的L02细胞抗氧化能力,抑制脂质代谢产物的产生,对酒精诱导的L02细胞损伤起到保护作用。（3）采用“灌胃一次性给予4 g/kg的40%乙醇溶液连续5周”的方法构建急性ALD的小鼠模型,通过实验证明NCVP对ALD的保护作用及其对肠道菌群的影响。不同剂量的NCVP均能显著降低肝脏指数,有效控制肝组织中转氨酶和甘油三酯的含量,改善由长期饮酒造成的肝细胞坏死且出现大量空泡、肝索排列紊乱以及炎性细胞浸润的现象;并且能够提升肝组织中抗氧化酶:SOD（超氧化物歧化酶）、GSH（谷胱甘肽）、GSH-Px（谷胱甘肽过氧化酶）的活性,抑制脂质过氧化物（MDA）和一氧化氮（NO）的产生。说明NCVP可以通过增强肝组织的抗氧化能力、降低血清中炎性因子白介素-6（IL-6）、白介素-1β（IL-1β）、肿瘤坏死因子（TNF-α）的过量表达抑制炎症反应的发生,对ALD起到保护作用。（4）为了探明NCVP对酒精性肝损伤小鼠肠道菌群的影响,本研究测定小鼠盲肠内容物的短链脂肪酸（SCFA）含量,并进行16s r RNA测序分析,进一步深入揭示NCVP对酒精性肝损伤的保护机制。结果显示,NCVP促进肠道内代谢产物总SCFA的产生。肠道菌群的角度分析表明,NCVP能够改善由酒精诱导的的肠道菌群结构的变化,增加有益菌的丰度,降低致病菌的丰度。在门水平上,NCVP能够降低Firmicutes/Bacteroides的比例以及Patescibacteria和Actinomycetes的相对丰度,显著增加Deferribacteres的相对丰度;在科水平上,NCVP显著增加能够促进产生丁酸的Lachospiraceae的相对丰度,以及Prevotellaceae和Lactobacillaceae的丰度,降低有害菌Ruminococcaceae和Helicobacteraceae的丰度;在属水平上,显著增加Desulfovibrio、Lachospiraceae-NK4A136和Provotellaceae-UCG-003的相对丰度,降低uncultured-bacterium和Helicobacter的相对丰度。因此,NCVP可能通过增加肝组织的抗氧化能力,抑制ALD小鼠炎症反应的发生,促进肠道内SCFAs的生成,重塑小鼠肠道菌群发挥对急性ALD的保护作用,初步证明“肠-肝轴”在NCVP的肝脏保护作用中发挥重要作用。