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肿瘤坏死因子是一种促炎症细胞因子,具有多种生物学效应。TNF-α以26k Dα的跨膜型结构tmTNF-α(trαnsmembrαne TNF-α)表达于细胞膜上,在金属基质剪切酶(TACE)的作用下,可被剪切为17k Dα的可溶性TNF-α,即s TNF-α(soluble TNF-α)。两型TNF-α通过其特异性的受体TNFR1和TNFR2介导对肿瘤细胞的生物学效应[1,2]。本课题组前期研究结果显示:tmTNF-α和s TNF-α介导的细胞生物学效应不尽相同,tmTNF-α能够杀伤对s TNF-α耐受的TNFR2高表达的HL-60肿瘤细胞株,其机制如下:tmTNF-α通过TNFR2信号,一方面可募集并且增强死亡信号分子FADD、RIP1和Cαspαse-8等促进凋亡,另一方面可诱导生存信号分子TRAF2和抗凋亡分子c IAP-1的48位泛素化,从而通过泛素-蛋白酶体途径被降解;并且下调抗凋亡分子c Flip表达,从而抑制NF-kB的活化,削弱生存信号,通过促进凋亡和抑制生存两种方式共同介导tmTNF-α的杀伤作用。泛素化是蛋白转录后的修饰过程,是调节细胞内功能的重要途径之一。泛素化修饰由E1泛素激活酶、E2泛素结合酶和E3泛素连接酶这3种酶的依次作用完成,泛素连接酶E3可特异性识别靶蛋白,如果发生48位赖氨酸泛素化,蛋白质靶分子被降解。泛素化降解指是经泛素修饰靶蛋白,在ATP供能的情况下通过泛素-蛋白酶体途径(UPS)将泛素修饰的蛋白质进行降解的过程。据报道:TRAF2的48位E3泛素连接酶为SIAH2。有报道提示,TNFR2胞内段由5个保守的结构域构成,I区-V区,而TNFR2的胞内段结构域III区,IV区和V区可能与TRAF2的降解或者结合有关,我们推测TNFR2的某些结构域可能也会募集E3连接酶SIAH2,促使TRAF2发生泛素化降解。但是tmTNF-α通过TNFR2介导肿瘤细胞杀伤是否具有普遍性;tmTNF-α通过TNFR2使TRAF2泛素化降解,从而介导对肿瘤细胞的杀伤,是否由48位E3泛素连接酶SIAH2介导;TNFR2的某个结构域是否可募集SIAH2以发挥促进TRAF2泛素化的作用,尚未报道。由此,结合前期结果,我们提出科学假说:tmTNF-α可能通过TNFR2的某个结构域促进48位E3泛素连接酶SIAH2泛素化降解TRAF2,以介导对肿瘤细胞的杀伤。本课题旨在研究tmTNF-α通过TNFR2介导肿瘤细胞杀伤的普遍性,进而阐明tmTNF-α通过TNFR2使TRAF2泛素化降解以介导对肿瘤细胞杀伤的分子机制,为抗肿瘤治疗提供新的干预靶点及策略。其主要研究结果如下:一.tmTNF-α通过TNFR2介导对Hep G2细胞的杀伤1.选择效应细胞和靶细胞流式细胞术检测tmTNF-α/NIH3T3稳转细胞系表面tmTNF-α的表达量为43.7%,即高表达tmTNF-α,可作为效应细胞;流式细胞术检测肿瘤细胞Hep G2表面TNFR1的表达量较低,为19.9±11.1%;而TNFR2表达量较高,为83.23±8.54%;满足对靶细胞的TNFR2表达为主的要求,可作为靶细胞。2.tmTNF-α可杀伤TNFR2表达为主的HepG2细胞,而sTNF-α则介导HepG2的增殖MTT法结果显示:tmTNF-α可杀伤TNFR2高表达而TNFR1低表达的靶细胞Hep G2,其杀伤率为51.5%,而s TNF-α对肿瘤细胞具有促进增殖的功能。3.转染TNFR1 siRNA对tmTNF-α介导的Hep G2杀伤无影响MTT法结果显示:转染TNFR1 siRNA之前,tmTNF-α对Hep G2的杀伤率为65.3%,与对照组相比,具有极显著性统计学差异(P<0.001),而转染TNFR1siRNA后,与未转染siRNA的实验组相比,tmTNF-α的杀伤率无显著变化。转染TNFR1 siRNA前后,s TNF-α组对Hep G2杀伤率很低(20.37±3.80%)且无显著性差异。4.转染TNFR2 siRNA可使tmTNF-α对HepG2的杀伤率显著下降MTT法结果显示:转染TNFR2 siRNA之前,tmTNF-α对HepG2的杀伤率为67.2%,与对照组相比,具有极显著统计学差异(P<0.0001);而转染TNFR2siRNA后,与未转染siRNA的实验组相比,tmTNF-α对Hep G2细胞的杀伤率显著下降为22.4%(P<0.001)。转染TNFR2 siRNA前后,s TNF-α组对Hep G2表现为增殖效应(20.03±5.78%)且无显著性差异。二.tmTNF-α通过TNFR2使TRAF2泛素化降解以介导对肿瘤细胞的杀伤1.tmTNF-α-TNFR2可募集E3连接酶SIAH2Co-IP结果显示:与对照组相比,tmTNF-α通过TNFR2募集的复合物中,E3连接酶SIAH2蛋白的含量明显升高,s TNF-α则可明显抑制SIAH2蛋白的募集;2.SIAH2可通过泛素-蛋白酶体途径使TRAF2发生泛素化降解转染SIAH2 siRNA,并进行泛素化抗体的IP实验,结果显示:在tmTNF-α-TNFR2通路中,以SIAH2 siRNA沉默SIAH2的表达,可显著抑制TRAF2募集多聚泛素链,即抑制TRAF2的泛素化,提示tmTNF-α-TNFR2通过E3连接酶SIAH2使TRAF2发生泛素化降解。而蛋白酶体抑制剂MG132作用4h后,TRAF2不能募集到多聚泛素化链,进一步说明48位E3连接酶SIAH2能通过泛素-蛋白酶体途径促进TRAF2的泛素化降解。3.SIAH2介导的TRAF2泛素化的降解依赖于蛋白质合成Western Blot结果显示:随着作用时间的延长(0h,6h,12h,24h),放线菌酮CHX可明显抑制E3连接酶SIAH2的表达,从而下调对TRAF2的泛素化降解,抑制tmTNF-α的杀伤效应。4.TNFR2的III区(343-378)结构域可募集SIAH2,使TRAF2泛素化降解首先成功构建TNFR2各结构域突变体(Δ424-439-TNFR2,Δ379-439-TNFR2和Δ343-439-TNFR2),酶切及测序鉴定表明各突变体构建成功。随后转染重组质粒TNFR2及TNFR2各结构域突变体于293T细胞48h,以tmTNF-α作用30分钟,提取各组细胞总蛋白,以TNFR2抗体为钓饵,进行co-IP。Co-IP结果显示:在tmTNF-α-TNFR2通路中,Δ424-439-TNFR2(缺失V区结构域),Δ379-439-TNFR2(缺失IV区+V区结构域)突变体都没有对TNFR2对SIAH2的募集产生影响,而Δ343-439-TNFR2(缺失III区+IV区+V区结构域)则明显抑制TNFR2对SIAH2的募集。提示在tmTNF-α作用下,III区(343-378)结构域介导TNFR2对SIAH2的募集,使TRAF2发生泛素化降解。综上所述,本文研究结果表明:tmTNF-α可杀伤TNFR2表达为主的肿瘤细胞,而s TNF-α则介导肿瘤细胞的增殖。tmTNF-α对Hep G2的杀伤依赖于TNFR2而非TNFR1的信号通路。tmTNF-α-TNFR2信号通路中,E3泛素连接酶SIAH2可使TRAF2通过泛素-蛋白酶体途径发生泛素化降解,且该降解依赖于蛋白质合成。在tmTNF-α作用下,TNFR2的III区(343-378)结构域可募集SIAH2,使TRAF2泛素化降解。本研究阐明tmTNF-α通过TNFR2使TRAF2泛素化降解以介导对肿瘤细胞杀伤的分子机制,且为抗肿瘤治疗提供了新的干预靶点及策略。