连钱草活性多糖结构及迷迭香酸的代谢研究

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连钱草为唇形科植物活血丹Glechoma longituba(Nakai)Kupr.的干燥地上部分,有利湿通淋,散瘀消肿和清热解毒等功效,临床上主要用于利小便、治疗膀胱结石、肾结石、输尿管结石、肾炎水肿、湿热黄疸、胆囊炎、胆石症、腮腺炎、烧伤等。研究表明清热解毒中药往往都具有抗补体活性,为了阐述连钱草清热解毒的药效物质,我们对连钱草的抗补体活性的进行了筛选,结果发现连钱草75%醇提物抗补体活性较弱,而其粗多糖具有较好的抗补体活性。为了明确连钱草抗补体的活性成分,就连钱草粗多糖进行了进一步的纯化,从中共分离出了2个有抗补体活性的均一多糖,分别为GLP-1和GLP-2。通过多种理化方法表征了两个均一多糖结构特性。GLP-1,棕褐色疏松状,其主要为2种单糖组成的杂多糖,单糖组成为阿拉伯糖和半乳糖,其中阿拉伯糖和半乳糖的摩尔比为1:6.3。GLP-1的分子量为5.37 KDa,蛋白质含量为0.94%,糖含量为94.8%。甲基化的结果结合核磁共振波谱数据,表明GLP-1是主链为1,6连接的半乳糖以及少量的1,3,6-连接的半乳糖,支链连接为1-连接阿拉伯糖终端和1-连接半乳糖终端,原子力显微镜结果表明其空间结构较为疏松,卷曲程度较高。GLP-2与GLP-1的结构较为相似,浅黄色疏松状,GLP-2主要由阿拉伯糖和半乳糖两种单糖组成,其中阿拉伯糖和半乳糖的摩尔比为1:4.9。GLP-2的分子量为20.04 KDa,蛋白质含量为0.95%;糖含量为93.5%。甲基化的结果及核磁数据显示:主链主要为1,6-连接的半乳糖以及少量的1,4,6-连接的半乳糖,支链连接为1-连接的阿拉伯糖终端和1,4-连接的半乳糖。原子力显微镜结果表明GLP-2的空间结构卷曲度较低,具有较为密集的网状连接特性。抗补体活性研究结果表明,GLP-1和GLP-2都具有较强的抗补体活性,CH50分别为0.028±0.011mg/mL,0.056±0.015 mg/mL,与阳性对照肝素钠(CH50为0.041 mg/mL)相当,GLP-1较GLP-2的抗补体活性好,可能与其空间构象有关。补体系统与炎症的诱发有紧密联系,我们就两个均一多糖的抗炎活性进行了进一步的研究。巨噬细胞在炎症反应中有相当重要的作用,炎症反应会诱发炎症因子的产生。因此我们就脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)刺激巨噬细胞诱导炎症反应产生炎症因子,将NO释放抑制率作为评价指标,通过测定炎症因子IL-6、IL-1β和TNF-α的释放量探讨其抗炎活性的作用机制,研究结果发现均一多糖对炎症细胞NO的释放量有明显抑制的作用,说明连钱草均一多糖GLP-1和GLP-2有明显的抗炎活性,且GLP-1的效果要比GLP-2的效果好。均一多糖GLP-1和GLP-2对炎症因子IL-6和TNF-α的释放有明显的抑制,但均一多糖对炎症因子IL-1β虽有抑制作用,但作用较弱,推测均一多糖GLP-1和GLP-2的抗炎活性作用机制可能主要是通过抑制炎症因子IL-6和TNF-α来发挥其抗炎活性。前期研究发现连钱草具有利尿通淋功效的主要活性成分是迷迭香酸,但目前迷迭香酸在大鼠体内的代谢研究报道较少。本实验采用超高效液相-四极飞行时间质谱(Ultra-High Performance Liquid Chromatography-Quadrupole-time-of-flight Mass Spectrometry,UHPLC-QTOF-MS/MS)技术结合诊断离子策略快速鉴定连钱草的主含量和活性成分迷迭香酸在大鼠尿液、血浆、粪便、胆汁和五脏中(心,肝,脾,肺和肾)的代谢产物。利用空白基质扣减技术、基于预测代谢物质量亏损的筛选技术及诊断离子和中性丢失策略快速锁定并鉴定迷迭香酸的代谢产物,总共在血浆、尿液、胆汁和粪便中鉴定了16个代谢产物,发现迷迭香酸在大鼠体内主要发生甲基化、磺酸化和葡萄糖醛酸化等代谢反应,代谢产物主要经尿液和胆汁排出体外,主要分布在肾脏。通过迷迭香酸体内代谢研究进一步表明该化合物作用靶点在肾脏,为其利尿通淋功效提供了一定的科学依据。
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