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目的:肝细胞生长因子(hepatocyte growth factor, HGF)是由间质细胞(如成纤维细胞、巨噬细胞)产生的多肽类细胞因子,又称间充质因子。HGF具有许多重要的生物学功能,如促进细胞的增殖、分裂;抑制细胞间隙连接的生成和细胞之间的粘附,导致细胞的离散;上调尿激酶型纤溶酶原激活物及受体(uPA/uPAR)的表达,促进细胞外基质降解;增加细胞骨架蛋白磷酸化,破坏细胞骨架,从而使细胞易于变形和迁移。因此,HGF又称促有丝分裂因子、离散因子、细胞形态发生素或促迁移因子。HGF在胚胎的发育、器官的形成、细胞的生长和迁移过程中发挥重要的调控作用,也与肿瘤的发生、进展、浸润、扩散和转移有着非常密切的关系。HGF的受体(hepatocyte growth factor receptor, HGFR)是原癌基因c-met编码的产物,又称c-Met。c-Met属于受体酪氨酸蛋白激酶家族成员,常由上皮细胞(如肝、肾、消化道细胞)表达。c-Met在肿瘤细胞表达增加,并与肿瘤细胞转移能力呈正相关。HGF由间质细胞分泌后,经旁分泌途径作用于周围靶细胞。HGF与受体c-Met结合后,导致受体二聚化和活化,进而激活细胞内不同的信号转导途径。已知HGF/c-Met活化的细胞内信号转导途经起码有三条,包括有丝分裂原激活的蛋白激酶信号转导通路(MAPK信号通路)、磷脂酶Cγ1/二脂酰甘油/蛋白激酶C信号转导通路(PLCγ1 /DAG/PKC信号通路)和三磷脂酰肌醇激酶/蛋白激酶B信号转导通路(PI3K/ PKB信号通路)。其中,PI3K/PKB和PLCγ/PKC信号转导途径是调控肿瘤细胞侵袭和转移的重要途径。KAI-1/CD82和MRP-1/CD9均属于4跨膜蛋白基因家族编码的产物。CD82是肿瘤转移抑制基因KAI-1编码的产物,目前被认为是广谱的肿瘤转移抑制因子。CD9又称细胞运动相关蛋白-1(motility-related protein-1)。二者均可下调癌细胞的运动性,从而抑制肿瘤细胞的浸润转移。对其作用机制研究表明,CD82和CD9通过与c-Met相互作用,抑制HGF诱导的c-Met酪氨酸蛋白激酶的活化,或抑制c-Met与整合素(integrins)的相互作用,下调c-Met对PI3K/PKB和PLCγ/PKC信号转导途径的活化,从而发挥其转移抑制作用。Hca-F细胞株和HCa-P细胞株为同一来源但具有不同淋巴结转移能力的两个细胞株。Hca-F为高淋巴道转移株,淋巴结转移率为80%,Hca-P为低淋巴道转移株,淋巴结转移率为0-20%。两细胞株淋巴道转移能力差别产生的分子机制尚不十分清楚。本课题主要比较两细胞株CD82/CD9和c-Met的表达以及PI3K/PKB和PLCγ1 /PKC信号转导通路的活性变化,以探讨肿瘤细胞淋巴道转移的分子机制。方法:小鼠腹水型肝癌Hca-F和Hca-P细胞株于小鼠腹腔培养。分别收集细胞后,分离提取细胞总蛋白,制备胞浆蛋白和颗粒结合蛋白。采用SDS-PAGE、Western Blotting技术及计算机扫描定量分析两细胞株CD82/CD9的表达和PI3K/PKB和PLCγ1 /PKC信号通路的活性。结果:1)CD82/CD9的表达:CD82在高淋巴道转移株Hca-F细胞和低淋巴道转移株Hca-P细胞中的表达没有显著性差别,Hca-P细胞CD9表达显著高于Hca-F细胞(Hca-P是Hca-F的1.31倍,P=0.4%,n=3),提示CD9可能是影响两细胞株淋巴道转移能力的主要因素。2)PI3K/PKB信号转导通路:采用Western Blotting技术对两细胞株PDK的表达和在细胞中的分布以及PKB磷酸化活化进行了比较分析。结果显示,两细胞株磷酸化PKB的表达无显著性差别;PDK在两细胞株的分布也无显著差异;说明PI3K/PKB信号转导通路不是影响两细胞株淋巴道转移能力主要途径。3)PLCγ1/PKC信号转导通路:采用Western Blotting技术对两细胞株PLCγ1及不同亚型PKCs的活性进行了比较分析。结果显示,淋巴道低转移株Hca-P细胞磷酸化的PLCγ1表达明显低于淋巴道高转移株Hca-F细胞(Hca-P是Hca-F的45.23%倍,P<0.05,n=3);Hca-P细胞中膜结合的PKCα、PKCβ1和PKCβ2含量明显低于Hca-F细胞(Hca-P细胞PKCα、PKCβ1和PKCβ2分别是Hca-F细胞的71.75%、76.80%和73.16%,P<0.05,n=3)。说明高转移株Hca-F细胞的PLCγ1/PKC信号转导通路的活性高于低转移株Hca-P细胞。PLCγ1/PKC信号转导通路可能是影响两细胞株淋巴道转移能力主要信号途径。结论:肿瘤转移抑制因子CD9在淋巴道低转移Hca-P细胞高表达;淋巴道低转移Hca-P细胞中的PLCγ1/PKC信号转导通路活性低。这可能是Hca-P细胞具有较低淋巴结转移能力的因素之一。推测可能是高表达的CD9与c-Met相互作用,抑制c-Met对Hca-P细胞PLCγ1/PKC信号通路的活化,从而降低Hca-P细胞的淋巴道转移能力。