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Mycoplasma bovis是感染牛的一种重要致病性病原体,主要引起牛肺炎、关节炎、乳腺炎、角膜结膜炎等疾病,给世界养牛业造成了很严重的经济损失。我国于2008年首次报道了M.bovis肺炎,该病原日益成为危害我国养牛业的重要因素。目前M.bovis无国际公认的特异性诊断方法,这给该疾病的防控带来困难。研究具有自主知识产权的M.bovis血清抗体ELISA试剂盒意义深远。本研究建立了M.bovis血清抗体检测ELISA方法并组装为试剂盒,填补了国内M.bovis ELISA试剂盒的空白。本实验的工作基础:本实验室完成了对M.bovis Hubei分离株全基因组的测序,利用生物信息学软件分析寻找到58个假定膜表面蛋白候选基因,通过PCR、构建重组质粒以及原核表达系统获得重组蛋白,用免疫学方法证明了一个编号为“P28”的重组蛋白具有免疫原性。本研究利用原核表达系统得到重组蛋白,将纯化后的P28重组蛋白作为抗原建立M.bovis血清抗体间接ELISA方法并组装成诊断试剂盒,命名为“MbH试剂盒”。首先,从不同批次MbH试剂盒中随机抽取用于试剂盒的敏感性、特异性、准确性、可检测宿主抗体持续期、重复性和稳定性性能评价。实验结果表明MbH试剂盒的敏感性为93.04%,特异性为97.80%,与牛传染性胸膜肺炎(CBPP)阳性血清等牛源性其它疾病阳性血清无交叉反应;MbH试剂盒检测结果与病原学和血清学诊断结果总体符合率为95.41%;MbH试剂盒可检测到感染发生一周后至的20周后的M.bovis血清抗体;可重复性实验结果表明,MbH试剂盒批间变异系数与批内变异系数均小于10%;保存期试验数据表明MbH试剂盒可在4℃封闭条件下保存14个月。其次,用已知血清样品对MbH试剂盒与其他两种进口商品化试剂盒(“Kit 1”和“Kit 2”)进行比较,考察MbH试剂盒与商品化试剂盒在敏感性、特异性、准确性指标的优劣以及3种试剂盒的一致性,结果表明:本实验室研制的MbH试剂盒敏感性与商品化试剂盒Kit 1相当;特异性实验结果表明MbH试剂盒与Kit 1与CBPP标准阳性血清无交叉反应,而Kit 2与标准CBPP阳性血清存在交叉反应;选取已知血清样品对MbH试剂盒与Kit 1进行比较,结果表明MbH试剂盒与Kit 1检测结果与综合诊断结果(包括病原学和血清学诊断)的符合率分别达到92%和96%,而Kit 2检测结果与综合检测结果符合率仅为74.67%;一致性检验结果显示MbH试剂盒与Kit 1有极强的一致性,而Kit 2与MbH试剂盒之间、Kit 2与Kit 1之间有中度的一致性。上述结果表明,MbH试剂盒具有良好的敏感性、特异性、准确性、可重复性和稳定性,与Kit 1的各种技术指标相当,可以作为进口试剂盒的替代品用于M.bovis的临床诊断与流行病学调查。