论文部分内容阅读
金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus,简称金葡菌)是人皮肤软组织感染、肺炎、脓毒症等的重要病原菌,其耐药性一直备受关注。万古霉素中等耐药金葡菌(vancomycin-intermediate S.aureus,VISA)于1997年首次在日本分离,其分离率逐年上升,该菌感染已成为临床万古霉素治疗失败的重要原因。VISA的耐药机制复杂,常与金葡菌二元调控系统的基因突变有关。另有研究表明,金葡菌在对万古霉素耐药性升高的同时,总伴随着一定程度的毒力降低,但机制不清。本课题组前期报道了一株ST239型VISA菌株XN108,基因组测序和位点回复实验证实二元调控系统WalKR的一个新突变位点Wal K(S221P)在金葡菌XN108的万古霉素中等耐药性中发挥重要作用,但该突变是否影响菌株的毒力及其机制不清。本研究在比较XN108及其Wal K(S221P)点突变回复株K65毒力的基础上,分析了金葡菌毒力相关基因的表达差异;探讨了Wal K(S221P)影响VISA菌株毒力的作用与机制;再后将WalK(S221P)点突变引入到不同遗传背景的金葡菌中,检测菌株万古霉素耐药性改变及毒力因子表达的变化。主要研究结果如下:1.XN108中WalK(S221P)突变回复导致VISA菌株毒力增强分别构建XN108(万古霉素MIC=12μg/ml)及其Wal K(S221P)点突变回复株K65(MIC=4μg/ml)感染小鼠皮肤脓肿模型。结果发现,在感染的第1-7天,K65组小鼠的皮肤脓肿面积较XN108感染组明显增大;组织学观察表明,K65感染后小鼠比XN108感染后小鼠的皮肤组织结构破坏更严重,炎症浸润更强;利用小鼠脏器定植模型,发现感染第7天,K65在小鼠脾脏和肾脏的细菌定植量显著高于XN108。以上结果表明,WalK(S221P)点突变导致VISA菌株毒力降低,回复突变后菌株的毒力增强。2.XN108的WalK(S221P)回复突变菌株的毒力相关基因表达上调对XN108和K65进行转录组测序(RNA-seq),RT-qPCR检测了13个毒力相关基因,其表达趋势与RNA-seq结果一致。RNA-seq的结果显示K65与XN108相比共有193个差异表达基因(差异倍数>2.0),其中118个上调,75个下调。在这些差异表达基因中,K65菌株的溶血素、脂酶等毒力因子基因表达明显上调,毒力调控系统Agr的表达显著上调。溶血实验证实,XN108中的Wal K(S221P)点突变被回复后,K65的溶血活性增强。3.Wal K(S221P)突变通过Agr调控系统影响VISA菌株毒力在前述RNA-seq研究中发现Wal K(S221P)突变可导致VISA菌毒力调控系统Agr的表达下调。通过构建Lac Z报告质粒,发现WalK(S221P)突变菌中agr启动子活性下降。生物信息学分析发现,在agr启动子区有潜在的Wal R结合位点,凝胶阻滞实验进一步证实经WalK磷酸化激活的WalR蛋白能直接与agr启动子区DNA片段相结合,表明WalKR可直接调控Agr表达,进而影响细菌毒力,Wal K(S221P)突变影响VISA菌的毒力是通过Agr调控系统实现的。4.引入Wal K(S221P)导致不同遗传背景金葡菌对万古霉素耐药性升高,毒力降低为深入探讨Wal K(S221P)突变对金葡菌万古霉素耐药性及毒力的影响,采用同源重组技术在甲氧西林敏感金葡菌(MSSA)Newman株和甲氧西林耐药金葡菌(MRSA)USA300株中引入WalK(S221P)突变,构建了K-Newman和K-USA300突变菌株。万古霉素敏感性试验结果表明,K-Newman对万古霉素的MIC值从野生株的1.0μg/ml上升至3.0μg/ml,K-USA300对万古霉素的MIC值也从0.75μg/ml上升到1.5μg/ml;利用RT-q PCR检测相关毒力基因表达水平,结果显示,在Newman和USA300菌株中引入突变后,α溶血素基因hla以及Agr系统基因agr A和RNAIII的表达水平显著下调;溶血实验结果也显示K-Newman和K-USA300溶血活性较野生株减弱。以上结果表明,在不同遗传背景的金葡菌中,引入Wal K(S221P)突变会增强菌株对万古霉素耐药性,同时呈现毒力降低的表型。综上所述,本研究发现VISA菌株中二元调控系统WalK(S221P)点突变回复后可使菌株的毒力增强,相应的毒力因子表达上调;进一步利用Lac Z报告实验和凝胶阻滞实验证实WalK(S221P)突变影响VISA菌毒力是通过附属基因调控系统Agr实现的。将WalK(S221P)突变引入到不同遗传背景的金葡菌株中,可使突变菌的万古霉素耐药水平升高,毒力因子表达水平降低。这些研究结果为深入理解万古霉素中等耐药金葡菌的毒力调控机制提供了新的实验依据。