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背景结核病(tuberculosis,TB)是由结核分枝杆菌(mycobacterium tuberculosis,MTB)引起的慢性传染病,根据有无MTB检出及临床症状可将TB分为活动性结核病(active tuberculosis,ATB)及潜伏性结核感染(latent TB infection,LTBI)两种截然不同的感染病程。TB是全球性的健康问题,每年因TB而死亡的人数居传染病之首。TB疫情如此严重与ATB快速诊断手段的欠缺、ATB与LTBI两种感染状态不易区分密切相关。目前TB的实验室诊断包括抗酸染色、细菌培养、PCR检测及γ干扰素释放实验等方法,但这些实验并不能简便、快速、准确的诊断ATB及区分ATB与LTBI。因此,本研究旨在通过分析ATB、LTBI及健康对照(healthy controls,HC)人群外周血中差异表达的细胞因子及长链非编码RNA(long non-coding RNA,lncRNA),以鉴定TB相关的宿主生物标志物,从而达到检测细胞因子含量或lncRNA表达水平就可辅助诊断ATB并同时区分MTB不同感染状态(ATB与LTBI)的目的。方法1.血浆细胞因子谱作为TB诊断标志物的研究:共纳入研究对象227人,其中149人作为发现队列,78人作为验证队列。发现队列共招募ATB患者50人,LTBI感染者49人,HC受试者50人。我们利用基于液体阵列的多重免疫测定技术检测三组人群血浆中38种细胞因子浓度,通过组间差异比较及雷达图、热图分析筛选出可用于诊断ATB、LTBI及鉴别诊断ATB与LTBI的生物标志物谱,使用ROC曲线及其曲线下面积(area under curve,AUC)两两比较评估单个细胞因子及多个指标联合的诊断效能。验证队列包含独立的ATB组28人,LTBI组24人,HC组26人,利用ELISA技术对可同时区分ATB、LTBI及HC的单个血浆生物标志物的水平进行检测,对其在TB的诊断效能进行再验证。2.外周血单个核细胞(Peripheral blood mononuclear cell,PBMC)差异表达lncRNA作为潜在TB诊断标志物的研究:我们首先通过转录组高通量测序(transcriptome sequencing,RNA-seq)技术检测了MTB弱毒株H37Ra、强毒株H37Rv刺激人THP-1巨噬细胞1到48小时后lncRNA的表达情况,生物信息学工具评估测序质量合格后,根据表达丰度、表达倍数变化、组间表达水平趋势筛选出相比对照细胞在结核菌刺激下差异表达的lncRNA,接着利用qRT-PCR技术验证lncRNA的表达与测序结果的一致情况。挑选qRT-PCR与测序结果一致的巨噬细胞来源lncRNA,同时纳入经文献调研并筛选后淋巴细胞来源的lncRNA,将两者合并。通过招募ATB组35人、LTBI组32人及HC组35人,分离PBMC(由淋巴细胞及单核细胞组成)并提取RNA,利用QRCR技术检测合并后lncRNA在ATB、LTBI及HC三组间的表达差异情况,探寻lncRNA诊断ATB、鉴别诊断ATB与LTBI的潜在价值。结果1.在发现队列中,雷达图及热图显示ATB、LTBI和HC三组间存在明显不同的细胞因子分泌模式。进一步,组间对比统计分析共发现8种在三组间差异表达的细胞因子,其中这8种(Eotaxin、MIP-1α、MDC、IP-10、MCP-1、IL-1α、IL-10、TNF-α)均有用于ATB诊断的潜在价值,5种(IP-10、MCP-1、IL-1α、IL-10、TNF-α)可作为LTBI诊断的生物标志物谱,3种(Eotaxin、MDC、MCP-1)可用于ATB及LTBI的鉴别诊断。ROC曲线分析发现8种可用于ATB诊断的生物标志物的联合检测的AUC可达到1.0;而可用于LTBI诊断的5种生物标志物谱从HC中区分LTBI的灵敏度及特异度分别为94%及81.25%;对于目前实验室检测手段无法区分的ATB及LTBI,我们的研究所发现的3种生物标志物谱的联合检测区分两者的AUC为0.9350,灵敏度及特异度分别为87.76%及91.84%。此外,MCP-1是本研究发现的唯一一个在ATB、LTBI及HC三组中任意两组间均存在明显差异的生物标志物。通过观察单个细胞因子诊断TB的AUC数值及细胞因子间的AUC配对比较结果,我们还发现MCP-1在诊断ATB及鉴别诊断ATB与LTBI时的AUC最大,分别为0.9832和0.9075,并且均高于其他7个指标(p<0.01)。在而后的验证队列的数据中,我们发现血浆MCP-1浓度对ATB的诊断及ATB与LTBI的鉴别诊断的AUC分别为0.9718和0.8936,与发现队列的数据基本一致。2.RNA-seq测序(mRNA+lncRNA)总体质量评估合格,由于lncRNA测序数据的存在,比单纯mRNA测序有更多序列分布于内含子区域及基因间区域。测序结果表明相比未处理对照细胞,MTB菌株(弱毒株H37Ra、强毒株H37Rv)刺激THP-1巨噬细胞48小时内共有296个lncRNAs存在差异表达情况。根据筛选标准:Ra、Rv、C组三组中lncRNA测序TMM值均在1以上;同一时相点间任意两组的lncRNA倍数变化均>1.5、p<0.05;同一时相点Ra组相比C组与Rv组相比C组的lncRNA差异表达高低方向一致;同一时相点C组到Ra组再到Rv组间的lncRNA表达呈现递增或者递减的关系,共计从296个lncRNAs筛选出17个lncRNAs。剔除qRT-PCR验证结果与测序结果表达不一致的7个lncRNAs,剩余的10个巨噬细胞来源lncRNAs加上根据文献纳入的5个淋巴细胞来源lncRNAs,共计15个lncRNAs用于TB患者PBMC层面生标的筛选。QRCR分析上述15个lncRNAs在PBMC中的表达情况,结果发现4个lncRNAs,即lnc-FAM110B-10、lnc-GUCY2C-1、NEAT1、MALAT1,在ATB与HC、ATB与LTBI间差异表达显著(p<0.05)。单个lncRNA诊断ATB的最大AUC为0.73、鉴别诊断ATB与LTBI的最大AUC为0.75,而4个lncRNAs联合后可以显著提高诊断效能,从HC中区分ATB的AUC达到0.87,区分ATB与LTBI的AUC达到0.88。结论ATB的快速诊断及ATB与LTBI的鉴别诊断是目前实验室TB检测方法的难点,我们的研究结果表明,血浆中差异表达的8种细胞因子谱及PBMC中差异表达的4种lncRNA谱可以用来区分ATB与HC、ATB与LTBI,指标联合后ROC曲线的AUC均在0.87以上,提示我们所发现的外周血中血浆层面及PBMC层面的生物标志物谱具有良好的诊断ATB、鉴别TB不同感染病程的应用价值。