论文部分内容阅读
硒(Se)是动物体在生长发育阶段必不可少的微量元素,同时,缺硒会对养猪产业造成严重威胁,通过食物链作用进一步危害人体健康。临床上缺硒会对动物消化系统造成损伤,引起动物腹泻,但缺硒对猪小肠损伤的分子机制仍不清楚。哈尔滨市地处中国缺硒带,为明确该地区猪缺硒性疾病流行病学情况及缺硒引起猪回肠损伤的分子机制,对哈市周边地区猪养殖场及散养户自2017年10月至2018年10月间出现的猪缺硒性疾病的病例数量及病例年龄进行统计,以计算发病率及易感年龄。为探究缺硒对猪回肠损伤作用的分子机制,分别建立缺硒猪体外及体内模型。体外模型使用缺硒培养基及正常培养基分别培养IPEC-J2细胞5天;体内模型将24头纯系大白雄性去势猪分成两组,分别饲喂16周缺硒日粮(硒含量0.007 mg/kg)和正常日粮(硒含量0.300 mg/kg)。通过对试验细胞及试验动物组织进行病理学观察和超微结构观察,探究缺硒对猪回肠的损伤情况。并进一步使用荧光实时定量PCR技术及蛋白免疫印迹法对TNF-α程序性坏死通路、NF-κB炎症通路及Th1/Th2相关基因的m RNA和蛋白表达水平进行检测,以揭示缺硒对猪回肠的损伤机制,结果表明:(1)哈尔滨市猪缺硒性疾病流行病学调查结果显示,2017年10月至2018年10月期间,哈尔滨市及周边地区散养户的猪缺硒性疾病发病率(7.94%)高于养殖场的猪缺硒性疾病发病率(0.64%);散养散户哺乳仔猪发病率(13.83%)高于断奶仔猪(7.77%)和育肥猪(2.21%)。结果表明,在哈尔滨市及周边地区,养殖场由于集约化养殖,仅有少数哺乳仔猪发生缺硒性疾病,而散养户的猪则面临一定的患缺硒性疾病的风险,应密切关注饲料的元素硒补充,做到对症治疗,并及时预防。(2)在体外试验中,经缺硒培养5天后,IPEC-J2细胞仍不能达到80%的增殖范围,且有多量细胞未能分化贴壁而成球状。使用流式细胞术分析显示,缺硒培养使细胞坏死率上升了4.5%。缺硒对IPEC-J2细胞的增殖与分化造成了严重影响且导致细胞坏死。(3)在体内试验中,经过16周缺硒饲喂,试验猪临床体温正常,但精神沉郁,行动迟缓,皮肤颜色发灰,肌肉松弛无力,腹部及臀部皮下轻微水肿,行走时后躯摆动,强迫运动时出现后肢颤抖,有轻微腹泻症状。剖检可见患猪皮肤苍白带微黄色,颈部和臀部皮下有黄白色胶冻样浸润,肌肉颜色灰白,出现桑葚心病变,胃内气体较多,部分肠道臌气并呈紫红色,肠黏膜少量出血。猪回肠组织的病理结构也发生明显变化,包括杯状细胞的数量减少、绒毛边缘模糊和组织中出现炎性细胞浸润等。另外,缺硒组的猪回肠绒毛长度显著低于正常组,且缺硒组的猪回肠隐窝深度显著高于正常组,同时,缺硒导致试验猪回肠绒毛长度与隐窝深度之比显著降低(P<0.05)。采用扫描电镜及透射电镜观察试验猪回肠组织超微结构,结果显示缺硒猪回肠组织表面绒毛出现破损,凹凸不平,回肠微绒毛出现缺失、破损且回肠组织中的细胞出现许多坏死典型特征:包括细胞破损、细胞核核膜破裂,染色质外漏,细胞核结构崩解、细胞器肿胀、线粒体嵴断裂、线粒体涨破等。以上结果表明缺硒对猪回肠组织造成损伤、破坏其消化功能及肠道黏膜屏障,并导致回肠组织发生坏死及炎症反应。(4)对IPEC-J2细胞及猪回肠组织中NF-κB途径及Th1/Th2相关基因进行检测发现,缺硒组中NF-κB、i NOS、COX-2和IL-1β的m RNA和蛋白质表达水平显著上调(P<0.05),IFN-γ、IL-10和IL-4的m RNA表达水平显著下调(P<0.05),表明缺硒可导致Th1/Th2平衡被破坏,并激活NF-κB途径引发炎症。(5)对IPEC-J2细胞及猪回肠组织中TNF-α程序性坏死通路相关基因进行检测发现,缺硒组中TNF-α、RIPK3、MLKL和FAS的m RNA及蛋白表达水平显著上调(P<0.05),表明缺硒可激活TNF-α程序性坏死途径,引发程序性坏死。综上所述,本试验首次对哈尔滨市猪缺硒性疾病流行病学进行调查,结果显示猪的缺硒性疾病表现为哺乳仔猪及断奶仔猪多发,且散养户的猪发病率高于养殖场猪发病率。本试验还阐述了缺硒引发猪回肠损伤的分子机制:缺硒会引发猪回肠组织发生损伤,引发Th1/Th2失衡并激活NF-κB炎症途径,并最终导致程序性坏死,为预防和评估养猪产业因缺硒引发疾病提供新的线索。