人工插核育珠是通过在珍珠贝体中植入可以分泌珍珠质的珍珠贝外套膜小片来实现的,珍珠的质量和颜色等特性大部分取决于提供小片供体贝的种类、珍珠质颜色和质量。海水珍珠贝的种类较多,包括合浦珠母贝(Pinctada fucata)、大珠母贝(Pinctada maxima)、珠母贝(Pinctada margaritifera)和企鹅珍珠贝(Pteria penguin)等,其大小、颜色、光泽各不相同,因此所产珍珠的大小、颜色和光泽也不同,其中大珠母贝、珠母贝的珍珠大,色泽好颜色正,珠粒圆润,但是它们现在的人工育珠技术难度大,海区也不能大规模养殖。而合浦珠母贝的繁殖、养殖和插核育珠技术都非常成熟,是生产海水珍珠常用的母贝。如果能利用大珠母贝或珠母贝的外套膜小片在合浦珠母贝体内育出相应种类的珍珠,即异种移植育珠,则可大幅度提高合浦珠母贝养殖的经济效益。珍珠养殖过程中外套膜小片植入受体贝后受到的免疫攻击是影响其存活、再生的关键因素,因此研究小片植入后尤其是种间移植后受体贝的免疫反应对育珠技术的改良和创新,尤其是对开创种间移植“借腹”育珠技术具有重要作用。为此,本论文开展了合浦珠母贝对移植小片的免疫排斥研究,主要结果如下:1、合浦珠母贝血清免疫因子对移植小片的免疫反应研究了合浦珠母贝在异种(珠母贝和大珠母贝)小片或者同种(合浦珠母贝)小片移植手术后1 d,2 d,3 d,4 d,5 d,7 d,9 d,11 d,13 d和15 d母贝血清免疫因子的变化,主要有溶菌酶(LZM),碱性磷酸酶(AKP),酸性磷酸酶(ACP),总抗氧化能力(TAC),和对兔红血细胞凝血能力大小。结果表明,实验组和对照组均对兔血红细胞有不同程度的凝集作用,其中植入合浦珠母贝小片贝的凝集效价在植入后1-5天达到25,高于其他组,7-15天低于其他组。实验组的抗菌活性在第2-4天显著大于对照组活性,且各个实验组间有显著差异(P<0.05),第5-11天小于对照组,第15天恢复正常水平。实验组的溶菌活力在第3-7天均显著高于对照组,且组间溶菌活力有显著差异(P<0.05)。实验组在第2-9天的ACP和AKP均大于对照组,且在第3-9天组间都是显著差异(P<0.05)。实验组的TAC在第1-7天都高于对照组,在第4-7天内组间显著差异(P<0.05)。上述结果表明,合浦珠母贝在异种和同种小片移植手术后,体液免疫系统对移植物均有免疫响应,但同种和异种之间没有显著差异。因此有必要进一步从分子免疫角度深入开展异种移植的免疫排斥机理研究。2、合浦珠母贝对大珠母贝外套膜小片的免疫排斥反应基于转录组测序技术,将大珠母贝小片合浦珠母贝(异种移植),并用合浦珠母贝小片移植作为对照(同种移植),分别于0 h,6 h,12 h,24 h,48 h,72 h和96 h以及未进行移植手术的贝进行血细胞取样、转录组测序,总获得107.93 Gb clean reads。然后分别对差异基因进行GO和KEGG富集分析,结果显示,细胞凋亡(apoptosis),hippo信号通路(hippo signaling pathway),氧化还原反应(oxidation-reduction),MAPK信号通路(MAPK signaling pathway),核糖体(ribosome),嘌呤的新陈代谢(purine metabolism),泛素的蛋白水解过程(ubiquitin mediated proteolysis)等通路显著富集。在异种移植手术和同种移植手术的对比中,移植手术后0小时DADH脱氢酶(NADH dehydrogenase),琥珀酸盐脱氢酶(succinate dehydrogenase)等相关脱氢酶类是异种移植组里高表达的主要差异表达基因,表明在移植手术的刚开始就有氧呼吸爆发,异种移植的比同种移植的严重得多。另外,热休克蛋白70(HSP70)在异种移植组中0-96h一直高表达。移植组和对照组相比,核糖体和hippo信号通路中的差异基因显著富集。随机挑选的10个差异表达基因的荧光定量分析结果和测序结果大体一致。这些结果说明了氧化还原反应是异种移植最重要的影响因素。3、合浦珠母贝同种移植的免疫排斥反应从上述结果发现合浦珠母贝同种移植也有免疫反应,所以进一步将合浦珠母贝同种移植后0h和48h的血细胞转录组数据进行分析,得到92.5 million reads。通过和参考基因组对比后进行比较分析,手术后0h和48h的样总共有798个差异表达基因,在48h样中有410个基因上调和388个下调。通过差异表达基因富集分析,发现白介素受体和toll样受体在48h高度表达,说明在手术后随着时间的推移贝的细胞因子免疫反应增大。随机选取18个差异表达基因来进行荧光定量验证,结果显示和测序结果一致。这些结果表明合浦珠母贝对同种小片移植也存在免疫反应,并以细胞因子为主免疫因子。