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轮状病毒(Rotavirus,RV)是人畜共患腹泻的重要病原之一,其中猪轮状病毒(Porcine Rotavirus,PoRV)是仔猪腹泻的重要病因之一。该病流行范围广,发病率较高,若与猪流行性腹泻病毒(PEDV)和猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)混合感染会使病情加重,导致高死亡率,从而给畜牧业造成严重的经济损失。本论文就PoRV-GD-01-2015的全基因测序、抗PoRV的单克隆抗体的制备以及检测PoRV的ELISA方法的建立三个方面展开研究,对PoRV疫苗的研发和致病机理的研究具有重要意义。1.PoRV-GD-01-2015的全基因序列分析本实验将一份经RT-PCR检测猪轮状病毒病原阳性的临床腹泻粪样感染Vero细胞,成功分离到一株猪轮状病毒GD-01-2015株;参照已发表的A组轮状病毒CC0912-1设计合成11对引物,对GD-01-2015进行全基因克隆测序,并对其11个基因片段进行RotaC软件分析、遗传变异分析和生物信息学分析。结果显示,GD-01-2015完整基因型为G5-P[7]-15-R1-C1-M1-A1-N1-T1-E1-H1;GD-01-2015 与韩国毒株 K5 核酸同源性高达 99%;生物信息学分析预测发现各蛋白都具有良好的抗原性,其中VP1、VP3、VP4、VP7、NSP1、NSP2和NSP4属于稳定蛋白,VP7和NSP4分别含有2个和1个跨膜区结构,且VP7属于疏水性蛋白。2.抗PoRV的单克隆抗体的制备将研究一中的PoRV-GD-01-2015感染Vero细胞,并将浓缩的含有PoRV-GD-01-2015的细胞液作为免疫原免疫小鼠,经过两次融合,以间接免疫荧光(IFA)方法为筛选方法,成功获得两株抗PoRV的单克隆抗体,并命名为PoRV-2F 10和PoRV-6F5。经Western-Blot验证所得单抗只识别病毒抗原。经商品化试剂盒鉴定,所得两株单克隆抗体的类型均为IgG,Kappa链。将两株单抗制备腹水后,利用Protein G柱获得了纯化的抗体,为后续建立检测方法奠定了基础。3.双夹心ELISA方法的建立通过相加ELISA方法确定PoRV-2F10和PoRV-6F5为针对不同抗原位点的两株单克隆抗体。将两株单克隆抗体进行交叉配对实验,结果确定以PoRV-6F5为捕捉抗体,PoRV-2F10为酶标抗体建立了检测PoRV的双夹心ELISA方法;通过实验条件的优化,确定了捕捉抗体和酶标抗体的最佳工作浓度分别为3.5μg/mL和0.25μg/mL,待检抗原和酶标抗体的最佳孵育时间均为60min,最佳显色时间为20min;阳性临界值的确定实验结果显示,当OD450>0.165时判为阳性;利用本实验建立好的双夹心ELISA方法检测PoRV,检测到的最低抗原量为1.3X105个TCID5o;交叉反应性实验结果显示本实验建立的双夹心ELISA方法只与PoRV有阳性反应,与TGEV和PEDV无交叉反应,与阴性Vero细胞也无交叉反应,表明该方法具有较好的特异性;通过批间批内重复实验,发现该方法的批内和批间的变异系数均小于10%,说明该方法可行、重复性好。