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研究背景和目的:MiRNA是长度约22个核苷酸的内源性非编码单链RNA,广泛存在于真核细胞生物中,通过与靶基因mRNA3’-UTR区互补配对诱导降解或抑制靶基因mRNA的翻译,参与基因的表达调控,进而影响了包括肿瘤发生发展等重要病理生理过程。单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphisms,SNPs)是指单个核苷酸替代、插入或缺失而形成的基因多态性,是目前最常见的遗传多态现象之一,大约每1900个核苷酸有一个碱基发生改变。MiR-146a是一类与炎症密切相关的miRNA,发生在miR-146a前体区域G>C多态性位点rs2910164改变了Pre-miR-146a茎环结构,多项研究发现miR-146a(rs2910164)基因多态性与乳头状甲状腺癌、乳腺癌和肺癌等疾病发生发展密切相关。宫颈癌是女性最常见的恶性肿瘤之一,其发病率位居女性恶性肿瘤第二位,仅次于乳腺癌。全球每年约有50万新发病例及27万死亡病例。高危型人乳头瘤病毒(HPV)感染是宫颈上皮内瘤变和宫颈癌发生的必要因素,但大部分妇女HPV感染均为一过性,经过一段时间后能被机体自然清除,只有少数持续高危型HPV感染才可能导致宫颈上皮内瘤变并发展为宫颈癌,HPV16/18明显较其他HPV类型感染患者宫颈癌发生率更高。多项研究表明宫颈癌的发生与miRNA的异常表达密切相关,其中miR-34a、miR-21等在宫颈癌呈现高表达,发挥致癌基因作用;而 miR-182、miR-125b、miR-133a、let-7a 等 miRNA 在宫颈癌中表达明显下调,发挥抑癌基因作用。本研究通过构建Pre-miR-146a真核表达质粒(rs2910164 G及C基因型),将其转染宫颈永生化上皮细胞和宫颈癌细胞系后检测miR-146a前体多态性对miR-146a表达的影响;过表达miR-146a后,miR-146a可能通过调节IRAK1、TRAF6促进宫颈癌细胞增殖,但对细胞凋亡无明显作用,为宫颈癌的预防和治疗提供新的思路。材料与方法:(1)含有0.1 ng/ml人重组EGF,0.05 mg/ml牛垂体提取物的无血清培养基培养宫颈上皮永生化细胞系(CRL-2615);含10%胎牛血清的DMEM高糖培养基常规培养HPV18阳性的宫颈癌HeLa细胞系和HPV18阴性的宫颈癌C-33 A细胞系,采用实时荧光定量PCR检测三组细胞系的miR-146a表达以及IRAK1、TRAF6 基因 mRNA 的表达。(2)在CRL-2615、HeLa和C-33A细胞系分别转染对照质粒或重组质粒,实验分组:阴性对照组:转染空载体质粒pcDNA3.1(+);实验组:转染质粒Pre-miR-146a-G或Pre-miR-146a-C。转染前一天铺6孔板,24小时后待细胞贴壁达60%～70%时进行转染,每孔转染质粒3μg,采用实时荧光定量PCR检测转染后各组miR-146a的表达变化。(3)MiRNA mimics过表达miR-146a后,实时荧光定量PCR检测转染宫颈癌HeLa和C-33 A细胞系的表达效率,CCK8法检测转染后过表达组、阴性对照组宫颈癌细胞的增殖能力;流式细胞仪检测过表达组、阴性对照组细胞周期的变化情况,Western Blot检测细胞周期相关蛋白(CyclinD1)的表达。(4)MiRNA mimics过表达miR-146a后,流式细胞仪检测过表达组、阴性对照组细胞凋亡情况的变化,Western Blot检测细胞凋亡相关蛋白(cleaved caspase3)的表达。(5)采用miRanda、PicTar和TargetScan等miRNA靶基因预测软件分析,结果显示 IRAK1、TRAF6 是 miR-146a 的靶基因,miRNA mimics 过表达 miR-146a后,实时荧光定量PCR检测宫颈癌HeLa和C-33 A细胞系中过表达组、阴性对照组TRAK1、TRAF6的mRNA表达情况;Western Blot检测检测过表达组、阴性对照组TRAK1、TRAF6的蛋白表达情况。(6)统计分析:采用SPSS 20.0统计软件处理分析数据,实验数据以均数±标准差(Means±SD)表示,进行方差齐性、正态分布检验,单因素样本均数比较用于三组实验数据之间的比较,采用单因素方差分析(One-Way ANOVA),P<0.05为差异具有统计学意义,*,P<0.05;**,P<0.01。结果:(1)与CRL-2615细胞系相比,宫颈癌HeLa和C-33 A细胞系miR-146a表达分别上升了 44.3倍和11.5倍(P<0.05);IRAK1、TRAF6 mRNA表达均显著升高(P<0.05)。(2)与转染空载体对照质粒相比,在CRL-2615细胞系中,转染质粒Pre-miR-146a-G 或 Pre-miR-146a-C 后 miR-146a 表达量上升了 333.0 倍和177.6倍(P<0.05);在宫颈癌HeLa细胞系中,转染质粒Pre-miR-146a-G或Pre-miR-146a-C 后 miR-146a 表达量上升了 517.0 倍和 639.8 倍(P<0.05);在宫颈癌C-33 A细胞系中,转染质粒Pre-miR-146a-G或Pre-miR-146a-C后miR-146a 表达量上升了 307.5 倍和 491.4 倍(P<0.05)。(3 MiRNAmimics过表达miR-146a后,宫颈癌HeLa 和C-33A细胞系miR-146a表达分别上升了 562.6倍和599.0倍(P<0.05);CCK8结果显示,转染48h、72h后,细胞活力显著增强(P<0.05);与对照组相比,G1期细胞显著降低HeLa(P=0.048)、C-33 A(P=0.022),S 期细胞明显增多 HeLa(P=0.018)、C-33A(P=0.046);cyclinD1 蛋白表达显著升高(P<0.05)。(4)MiRNA mimics过表达miR-146a后,宫颈癌HeLa和C-33 A细胞早期凋亡和总凋亡率均无明显变化(P>0.05),凋亡相关蛋白cleaved-caspase3表达水平无明显下降(P>0.05)。(5)MiRNA mimics过表达miR-146a后,在宫颈癌HeLa细胞系中,IRAK1、TRAF6基因mRNA分别降低为0.73倍和0.69倍(P<0.05);蛋白表达分别降低为0.62倍和0.88倍(P<0.05);在宫颈癌C-33A细胞系中,IRAK1、TRAF6基因mRNA分别降低为0.26倍和0.70倍(P<0.05);蛋白表达分别降低为0.51倍和0.27倍(P<0.05)。结论:(1)MiR-146a在宫颈癌细胞系中呈现高表达,并且HPV18阳性的宫颈癌HeLa细胞系较HPV18阴性的宫颈癌C-33 A细胞系表达量高,miR-146a的表达可能和HPV感染导致的宫颈癌发生相关。(2)MiR-146a前体多态性可改变宫颈癌中成熟体miR-146a表达,进而可能影响miR-146a对靶基因IRAK1和TRAF6的调控。(3)过表达miR-146a促进宫颈癌细胞的增殖,该过程可能通过靶向调节IRAK1和TRAF6基因相关,但过表达miR-146a对宫颈癌细胞的凋亡无明显影响。(4)MiR-146a可能通过促进宫颈癌增殖从而在宫颈癌发病机制中起到重要作用,进一步研究miR-146a与HPV感染的相关关系可能为宫颈癌防治提供新的思路。