急性髓性白血病（acute myeloid leukemia, AML）是一类起源于造血干细胞的、以大量遗传缺陷为特征的异质性恶性血液病。尽管近30年来AML的疗效有了明显的提高，完全缓解率已达70%-80%，其中有相当部分的患者达到长期生存甚至治愈，但大多数病人最终还是复发、死亡。最近的研究表明，虽然干细胞移植仍是其治愈的唯一途径，但随着化疗策略的不断改善，化疗的5年存活率已达50%，无病生存率亦达40%，与异基因干细胞移植的疗效相仿，从而缩小了化疗和移植间的差别，异基因移植还具有较高的相关死亡率（20~25%），因此移植并不具有更大的吸引力。深入研究AML的分子生物学机制有助于开展和设计针对AML特异性生物学特性的靶向治疗，消灭微小残留病变，进一步提高治愈率。硫氧还蛋白（thioredoxin, Trx）是一个分子量小的氧化还原蛋白，有一个二硫化物活性中心（CGPC），能可逆地催化许多氧化还原反应。Trx与肿瘤关系密切，有研究表明，Trx是一个新的癌蛋白，肿瘤组织中有Trx过度表达；另一方面，由于Trx具有抗氧化应激、免疫调节、修复再灌注损伤等活性，在动脉粥样硬化、间质性肺病、肺缺血再灌注损伤等疾病中具有保护作用。Trx与AML之间的关系如何却未见报道。本课题旨在研究Trx在AML中的表达及其治疗意义。首先采用Western Blotting方法检测Trx在AML中的表达情况，并探讨Trx与白细胞计数、缓解率、生存率之间的相关性；然后采用倒置显微镜、流式细胞仪、混合淋巴细胞反应、ELISA法等手段，进行AML缓解期外周血树突状细胞（dendritic cells,DCs）的体外培养与功能鉴定，在此基础上又采用Western Blotting、MTT方法分析Trx阳性AML-CR患者DCs中Trx的表达与分泌，并利用Trx抑制剂二酰胺做阻断实验分析Trx对DCs活化T细胞的影响；最后采用光学显微镜、DNA电泳、MTT法初步研究Trx抑制剂对AML原<WP=5>代细胞的抑增殖及促凋亡作用。通过研究Trx在AML的临床意义、AML/DCs免疫治疗中Trx对DCs活化T细胞的影响及Trx抑制剂对AML原代细胞的抑增殖及促凋亡作用，探讨Trx成为AML治疗干预靶点的可能性。第一部分：硫氧还蛋白在急性髓性白血病的表达及其临床意义为研究Trx在AML原代细胞的表达及其临床意义，采用Western Blotting方法检测20例初发AML细胞Trx表达，并对Trx与AML患者的临床特点及预后进行相关性分析。研究发现，Trx在AML中高表达，表达率为75%（15/20），而在正常人中不表达，Trx与患者的白细胞计数相关，白细胞计数是AML患者的危险因素。因此，Trx在AML的发病中起重要作用，为进一步研究Trx在AML的治疗意义奠定了可靠的基础。第二部分：硫氧还蛋白在急性髓性白血病的治疗意义分题1 急性髓性白血病/树突状细胞的体外培养与鉴定微小残留病（minimal residual disease,MRD）是导致AML复发的根本原因，人们一直在不断寻找根除MRD的方法。细胞免疫治疗方法的成熟，使根除MRD从而治愈AML成为可能。AML细胞在体内不能有效被T细胞识别，主要机制为70%的AML细胞表面缺乏共刺激分子CD80和CD86，不能提供T细胞活化必需的第二信号，从而导致肿瘤特异性T细胞克隆不应答。树突状细胞（DCs）作为体内功能最强的抗原提呈细胞（APCs），在体内外均能刺激辅助性T细胞和细胞毒性T细胞显著增殖，在肿瘤免疫治疗中发挥重要的作用，其疫苗已成功应用于B细胞淋巴瘤、黑色素瘤、多发性骨髓瘤和前列腺癌，并获得了良好的临床疗效。但DCs在外周血的含量极低，为了将DCs用于AML免疫治疗，初步探索从AML患者的外周血诱导扩增DCs的可能性，并对其特性加以研究，<WP=6>采用直接贴壁法对AML-CR患者的外周血单核细胞进行体外培养，在以正常人AB血清为基础的培养体系中加入GM-CSF、rhIL-4、rhCD40L等细胞因子，诱导单核细胞分化形成DCs，并以健康人为对照，利用倒置显微镜直接观察、瑞氏-吉姆萨染色观察，流式细胞仪进行DCs表型鉴定，利用MTT法进行混合淋巴细胞反应（MLR）检测其抗原刺激能力，利用ELISA方法检测DCs培养上清IL-12的分泌。结果表明，培养7天后的细胞具有和健康人外周血培养的DCs相似的DCs形态，并上调表达DCs特征性表面分子CD83及共刺激分子CD40、CD80、CD86，其中GM-CSF加rhIL-4、rhCD40L组较GM-CSF加rhIL-4 组更为明显（P<0.05），健康人组DCs中CD83表达上调又较AML-CR组显著。培养后的DCs可较强地刺激同种自体T淋巴细胞增殖，GM-CSF加rhIL-4、rhCD40L组较GM-CSF加rhIL-4 组刺激反应能力强，并且随着DCs浓度的增加，淋巴细胞增殖反应增强。培养的DCs自培养第5天始即有IL-12的分泌，到第7天达到高峰。由此可见，AML-CR患者外周血可以诱导出与健康人形态、表型及功能相似的DCs，可用于AML缓解后的免疫治疗。分题2 硫氧还蛋白对急性髓性白血病/树突状细胞活化T细胞的影响为研究Trx对急性髓性白血病/树突状细胞（AML/DCs）活化T细胞的影响，首先采用直接贴壁法对Trx阳性AML完全缓解期细胞进行体外诱导，通过形态学观察及流式细胞仪分析证实培养出AML-CR/DCs，然后以Western Blotting方法检测AML-CR/DCs中Trx的表达及AML-CR/DCs与同种自体T细胞相互作用时Trx的分泌，并通过Trx抑制剂对Trx?