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托品烷生物碱是一类从茄科植物如莨菪,曼陀罗及三分三等植物中提取到的抗胆碱药,主要作用于副交感神经系统,具有麻醉、解痉、止痛等功能,在临床上有着十分广泛的用途,市场上供不应求。其中莨菪碱(hyoscyamine)和东莨菪碱(scopolamine)是托品烷生物碱的两种主要作用成分,在植物中含量低,。因此,利用现代生物技术,将托品烷生物碱合成途径中关键酶基因导入含托品烷生物碱植物中获得转基因发根系,继而进行大规模培养,是提高托品烷生物碱产量的最佳途径。本研究以药用植物三分三(Anisodus acutangulus)为材料,克隆托品烷生物碱合成途径中的两个关键酶基因:腐胺N-甲基转移酶基因(AaPMT)和莨菪碱6β-羟化酶基因(AaH6H);并对基因的特征、表达分析、诱导调控等方面开展了一系列的研究,获得了以下的结果:一.首次克隆了莨菪碱生物合成途径中关键酶“三分三腐胺N-甲基转移酶”的编码基因AaPMT,该基因全长cDNA为1237bp,含有一个960bp的开放阅读框,编码一个具有319个氨基酸的多肽,推测该蛋白的等电点为5.51,分子量大小约为35.1kDa。生物信息学分析表明,从三分三植物中分离得到的AaPMT基因与从其他含托品烷生物碱植物中分离到的PMT基因具有高度的同源性,属于S-腺苷甲硫胺酸依赖的甲基转移酶基因家族。系统进化分析表明,AaPMT蛋白同其他S-腺苷甲硫胺酸依赖的甲基转移酶来自共同的祖先,并且同颠茄及唐古特山莨菪中PMT蛋白具有最近的亲缘关系。Southern杂交结果显示PMT在三分三中可能存在双基因。二.首次克隆了莨菪碱生物合成途径中关键酶“莨菪碱6β-羟化酶”的编码基因AaH6H,该基因全长cDNA为1392bp,含有一个1032bp的开放阅读框,编码一个具有344个氨基酸的多肽,推测该蛋白的等电点为5.09,分子量大小约为38.7kDa。生物信息学分析表明,从三分三植物中分离得到的AaH6H基因与从其他含托品烷生物碱植物分离到的H6H基因具有高度的同源性,属于2-氧-戊二酸依赖的二氧合酶基因家族。系统进化分析表明AaH6H基因与唐古特山莨菪中克隆的H6H基因具有最近的亲缘关系。Southern杂交揭示AaH6H基因属于一个多基因家族。组织特异性表达谱分析发现,AaH6H基因在根、茎、叶三种组织中都有表达,表明AaH6H是一种组成型表达基因,这在含托品烷生物碱植物中还是首次发现。甲基茉莉酸诱导实验揭示,AaH6H在三分三不同部位具有不同的表达调控方式。三.构建以烟草花椰菜病毒(CaMV 35S)启动子驱动,含AaH6H和AaPMT双价植物表达载体pCAMBIA1304~+ + AaH6H + AaPMT,并转化进入发根癌农杆菌C58C1感受态细胞,用于转化三分三。