【摘 要】
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目的:探讨LAT-PLC-γ1对T细胞的分化调控及其可能相关机制,以及就哮喘中LAT对调节性T细胞分化影响进行相关研究。方法:（1）构建LAT质粒,基因测序检测LAT质粒内c DNA序列正确性。（2）使用OVA致敏和激发的方法构建哮喘小鼠模型,滴鼻法体内转染LAT质粒,Real-time和Western blot检测LAT m RNA和蛋白的表达,确定转染时间节点。（3）H&E染色和PAS染色观察
【基金项目】
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哮喘中T细胞活化衔接子对调节性T细胞调控研究（国家自然科学基金）；
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目的:探讨LAT-PLC-γ1对T细胞的分化调控及其可能相关机制,以及就哮喘中LAT对调节性T细胞分化影响进行相关研究。方法:（1）构建LAT质粒,基因测序检测LAT质粒内c DNA序列正确性。（2）使用OVA致敏和激发的方法构建哮喘小鼠模型,滴鼻法体内转染LAT质粒,Real-time和Western blot检测LAT m RNA和蛋白的表达,确定转染时间节点。（3）H&E染色和PAS染色观察肺组织病理变化,肺泡灌洗液计数检测肺组织内细胞分类变化,流式细胞检测法检测各组别小鼠体内CD3+、CD4+和CD8+T淋巴细胞数量变化。（4）ELISA法检测BALF上清中CD4+T淋巴细胞各亚群细胞因子表达水平。流式细胞检测法检测小鼠体内LAT转染对肺CD4+T淋巴细胞分化的影响。免疫磁珠阳性分选法分离小鼠肺组织中CD4+T淋巴细胞,Real-time PCR法检测肺组织CD4+T淋巴细胞内LAT和PLC-γ1 m RNA表达,Western bolt法检测肺组织CD4+T淋巴细胞内LAT、PLC-γ1和磷酸化PLC-γ1蛋白表达,免疫共沉淀法检测LAT和PLC-γ1蛋白相互间作用。（5）Western bolt法检测小鼠肺组织CD4+T淋巴细胞内Raf/Mek/Erk信号通路中p-Raf、p-Mek和p-Erk及PI3K/Akt/CREB通路中p-PI3K、p-Akt（Thr308）、p-Akt（Ser473）和p-CREB蛋白表达水平。（6）免疫磁珠阴性和阳性分选法分选哮喘小鼠脾脏CD4+CD25+Treg细胞,Real-time PCR和Western blot法分别检测CD4+CD25+Treg细胞内LAT和Foxp3 m RNA和蛋白表达。（7）体外扩增CD4+CD25+Treg细胞,流式细胞法检测CD4+CD25+Treg细胞凋亡,LAT质粒电转法转染CD4+CD25+Treg细胞,给予不同CD4+T淋巴细胞诱导分化条件,流式细胞法检测CD4+CD25+Treg细胞分化情况;CSDA-SE染色,流式细胞法检测CD4+CD25+Treg细胞抑制功能。结果:（1）成功构建LAT质粒;体内转染LAT质粒可以减轻哮喘小鼠肺部病理改变。（2）哮喘小鼠肺部CD3+T淋巴细胞数量减少,CD4+和CD8+T淋巴细胞数量无明显差异;体内转染LAT质粒后,CD3+、CD4+和CD8+T淋巴细胞数量均增加,而CD4+T淋巴细胞增加最为明显。（3）过表达LAT升高哮喘组小鼠BALF中降低的Th1相关细胞因子（IL-2和IFN-γ）和Treg细胞相关细胞因子（IL-10和TGF-β）,抑制过度升高的Th2细胞相关细胞因子（IL-4和IL-5）。过表达LAT促进哮喘小鼠肺组织内CD4+T淋巴细胞向Th1细胞和Treg细胞分化,抑制其向Th2细胞分化。（4）过表达LAT可增加哮喘小鼠体内磷酸化PLC-γ1蛋白表达,升高降低的LAT-PLC-γ1蛋白间关联。（5）过表达LAT可以降低哮喘小鼠CD4+T细胞内Raf/Mek/Erk信号通路中增加的p-Raf、p-Mek和p-Erk蛋白及PI3K/Akt/CREB通路中p-PI3K、p-Akt（Thr308）、p-Akt（Ser473）和p-CREB蛋白表达。（6）哮喘小鼠CD4+CD25+Treg细胞内LAT和Foxp3 m RNA和蛋白表达降低。哮喘小鼠CD4+CD25+Treg细胞在体外可继续向Th1、Th2和Th17细胞分化,而对照组小鼠脾脏CD4+CD25+Treg细胞在体外可继续向Th17细胞分化。哮喘小鼠CD4+CD25+Treg细胞抑制功能减弱。（7）转染LAT质粒后,哮喘小鼠CD4+CD25+Treg的Foxp3 m RNA和蛋白表达增加。CD4+CD25+Treg细胞在体外向Th1和Th2细胞分化能力消失,抑制功能增强。结论:（1）体内过表达LAT可改善哮喘小鼠肺部炎症病理变化。（2）体内过表达LAT影响哮喘小鼠肺内T淋巴细胞数量变化,其中对CD4+T淋巴细胞影响尤为明显。（3）LAT-PLC-γ1关联,特别是PLC-γ1磷酸化可以通过调控Th2/Treg细胞平衡减轻哮喘中过度活化的Th2细胞反应,这种调控作用与Raf-Mek-Erk和PI3K-Akt-CREB信号通路相关。（4）哮喘中CD4+CD25+Treg细胞在体外有继续分化为CD4+T淋巴细胞其他亚群的能力,这种继续分化能力与LAT和Foxp3的低表达相关。（5）哮喘中CD4+CD25+Treg细胞抑制功能减弱,过表达LAT可以增强CD4+CD25+Treg细胞抑制功能。
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