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小热激蛋白(small heat shock proteins,sHSPs)是由典型的C端、N端和α晶状体组成的蛋白家族,分子量一般在12~42 kDa左右。课题组前期的转SlCIF基因番茄果实转录组分析中,筛选出小分子热激蛋白17.7基因(SlHSP17.7)在番茄(Solanum lycopersicum)果实成熟过程中高度表达,但其在番茄果实发育中的作用机制尚不清楚。本研究通过构建成熟期番茄果实cDNA文库,筛选与SlHSP17.7互作的蛋白,进而探索SlHSP17.7在果实发育进程中的可能作用途径。以Micro-Tom番茄绿熟期、转色期和完熟期果实cDNA为模板,构建番茄果实cDNA文库。构建pGBKT7-SlHSP17.7诱饵载体筛选与其互作的蛋白,通过体内双分子荧光互补(bimolecular fluorescence complementation,BiFC)和体外GST-pull down分析,验证与SlHSP17.7的互作蛋白,为进一步阐明SlHSP17.7调控番茄果实低温耐受性的分子机制奠定基础。主要试验结果如下:1、构建了番茄果实cDNA文库,经检测番茄果实cDNA文库库容是2.2×10~6 cfu,工作液细胞密度是3.6×10~7 cell/mL,均一化程度大于10~6,说明所构建的番茄果实cDNA文库符合质量要求,可以进行后续实验。2、构建pGBKT7-SlHSP17.7诱饵载体,转化Y2HGold酵母菌株,经检测发现,该诱饵载体的表达无毒性,也不存在自激活现象,可用于进一步的筛选文库。3、以pGBKT7-SlHSP17.7为诱饵,筛选番茄果实cDNA文库,获得的阳性克隆进行测序及序列比对分析,找到可能与SlHSP17.7互作的蛋白为钙/阳离子交换体蛋白SlCCX1-like,并通过酵母双杂交实验验证发现二者存在互作关系。4、采用RT-PCR方法克隆获得SlCCX1-like全长,构建含有GST标签的原核表达载体,并诱导表达,与之前表达成功的SlHSP17.7共同进行pull-down实验并进行Western Blot分析,结果证明SlHSP17.7和SlCCX1-like这两个蛋白可发生直接相互作用,表明SlHSP17.7和SlCCX1-like可以在体外进行互作。5、采用双分子荧光互补系统BiFC,分别将SlHSP17.7、SlCCX1-like连入pXCGW和pXNGW载体,构建四个功能载体,通过农杆菌介导法将SlHSP17.7-cCFP和SlCCX1-like-nYFP,SlHSP17.7-nYFP和SlCCX1-like-cCFP两对基因,瞬时侵染烟草叶片。结果表明,融合表达载体组合侵染烟草叶片,36~48h内以共聚焦显微镜下在烟草叶片侵染部位观察到了清晰的绿色荧光,荧光分布在内质网膜上,说明二者存在互作关系。6、以SlHSP17.7的转基因沉默与过表达番茄果实为材料,采用实时定量PCR的方法检测转基因植株中SlCCX1-Like的表达,结果表明SlHSP17.7负调控SlCCX1-Like的表达。