花粉管伸长是一个顶端极性生长的过程,精细胞随着花粉管的伸长被运输到胚囊以完成双受精。囊泡运输将新的膜物质和细胞壁物质运输到花粉管顶端以保证顶端的扩展。在此过程中,高尔基体发挥着关键的作用。植物细胞中,高尔基体内囊泡的转运以及维持高尔基体结构和功能的分子机制依然不清楚。酵母及哺乳动物细胞中的研究揭示,COG复合体(Conserved Oligomeric Golgi complex)是一个囊泡拴系因子,在高尔基体内的囊泡逆向运输中发挥着关键的作用。植物细胞中研究发现,COG复合体在拟南芥的胚胎发育、花粉管极性顶端伸长的过程中发挥关键作用,以及参与到大麦抵抗大麦白粉病真菌侵染的过程中。本研究通过遗传学及细胞学手段的运用,证明了 COG6亚基在拟南芥花粉管快速伸长过程中发挥着十分关键的作用。1.COG6基因突变使花粉管的伸长受到严重影响,导致雄配子体无法正常传递我们在对cog6突变体植株进行繁种的过程中,发现植株的后代中没有纯合体株系,而所产生的野生型和杂合体株系的分离比大致为1:1,因此怀疑突变体植株的配子体传递出现了问题。进一步遗传分析表明,雌配子体传递没有受影响,而雄配子体的传递被完全地阻断。亚历山大染色显示cog6/+;qrt1/-突变体四个花粉都具有活性,扫描电镜(scanning electron microscopy,SEM)显示 cog6/+;qrt1/-突变体花粉的外壁形态正常,DAPI染色显示每个花粉中包含两个精细胞和一个营养细胞,花粉发育正常。体外萌发实验表明,与野生型萌发率相比差异很小,但花粉管的形态却差异显著。cog6花粉管表现出畸形以及爆裂表型。体内萌发的结果同样表明其无法在花柱中伸长。花粉管形态的缺陷导致雄配子体无法传递,从而导致雄性不育。此外,这种雄性不育的表型能够被花粉特异启动子LAT52启动的COG6-GFP以及COG6基因组DNA表达的质粒成功回补,说明cog6突变体的雄性不育表型的确是由COG6基因的缺失所导致。2.COG6基因在花粉及花粉管中表达强烈,COG6蛋白定位在高尔基体基因的表达模式常预示其可能发挥功能的组织部位,GUS染色的结果显示COG6基因在拟南芥中各组织中均有表达,且表达时期开始于花粉的二核期,在成熟的花粉及花粉管中具有更强的表达。COG6蛋白与高尔基体marker蛋白γ-COP1有很好的共定位,说明COG6定位于高尔基体。3.COG6基因突变影响了高尔基体形态以及蛋白的定位我们用定位于高尔基体的EMP12-GFP与ERD2-GFP作为marker,分别观察其在野生型与突变花粉和花粉管中的荧光形态,发现在野生型中两者为典型的长棒状,但是在突变体花粉及花粉管中,EMP12-GFP标记高尔基体的形态为小的圆点状,ERD2-GFP标记的高尔基体为小的相连的圈状。这说明COG6基因突变使高尔基体形态受到影响,高尔基体蛋白的定位也发生改变。透射电镜(Transmission electron microscopy,TEM)显示突变花粉中高尔基体的结构被破坏,潴泡更加粗短,潴泡间的极性变得不明显。4.COG6基因突变影响了花粉管细胞壁物质的正确沉积高尔基体是组成花粉管壁的主要成分果胶的合成场所,并且在分泌途径中作为分选中心。因此,我们对突变体的花粉管壁中的多糖物质进行染色分析,结果表明,突变体花粉管壁中的胼胝质均匀地分布在整个花粉管区域,而cog6突变体中花粉管的顶端果胶的沉积出现异常,而纤维素的沉积并未受到影响。从而得出结论:cog6突变体花粉管壁的胼胝质和果胶不能在花粉管中正确运输,这可能是导致花粉管形态存在异常,进而造成雄性不育的直接原因。