【摘 要】
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阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease,AD）是致命性的神经退行性疾病。越来越多的研究表明,β-淀粉样蛋白（Amyloidβ-Protein,Aβ）异常沉积形成的淀粉样斑块是AD发病的主要原因,体外培养神经元细胞来筛选拮抗Aβ毒性的药物是开发治疗AD的先导策略。所以提出有希望的治疗策略是通过抑制Aβ聚集,阻止淀粉样斑块的形成,拮抗氧化应激带来的损伤。所以我们合成富氢GO-C3N4-P
【基金项目】
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项目名称:石墨烯量子点促进神经干细胞分化为神经元应用于帕金森疾病治疗,项目合同编号:GCICB-IE-2018008,项目来源:广西生物医药协同创新中心 2018 年研究生创新创业资助项目,项目起止时间:2018-2019; 项目名称:基于石墨相氮化碳纳米片的双基因协同输送系统用于小鼠胚胎神经干细胞定向诱导分化及脑内移植治疗帕金森疾病,项目合同编号:81860256,项目来源:国家自然科学基金,项
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阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease,AD）是致命性的神经退行性疾病。越来越多的研究表明,β-淀粉样蛋白（Amyloidβ-Protein,Aβ）异常沉积形成的淀粉样斑块是AD发病的主要原因,体外培养神经元细胞来筛选拮抗Aβ毒性的药物是开发治疗AD的先导策略。所以提出有希望的治疗策略是通过抑制Aβ聚集,阻止淀粉样斑块的形成,拮抗氧化应激带来的损伤。所以我们合成富氢GO-C3N4-Pd复合纳米材料用于拮抗氧化应激对PC12细胞带来的损伤,以期生物还原氢通过拮抗氧化应激的损伤,抑制Aβ的聚集,防止淀粉样斑块的形成,恢复线粒体功能障碍,阻断突触和神经元凋亡,为后续研究氢气疗法治疗AD提供理论基础和科学依据。研究目的:探索富氢GO-C3N4-Pd纳米复合材料对Aβ25-35致大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤细胞（rat pheochromocytoma,PC12）氧化应激损伤的保护作用,并尝试对其相关机制做初步研究。研究方法:（1）取传代2-10代的PC12细胞接种在事先铺好Cultrex Mouse Collagen IV的孔板内,24 h后加入50 ng/m L NGF诱导为神经元细胞,第6天时,用微管相关蛋白-2（Microtubule-Associated Protein-2,MAP2）抗体对诱导后的PC12通过细胞免疫荧光进行验证是否分化为成熟神经元细胞;（2）向分化成熟的PC12细胞中加入终浓度为0（对照组）、10、20、40、60、80μmol/m L的老化Aβ25-35溶液处理24 h构建AD细胞模型,通过CCK8法检测确定构建AD细胞模型合适的Aβ25-35工作浓度以及作用时间;（3）超声处理GO-C3N4-Pd粉末得到GO-C3N4-Pd复合纳米材料,利用透射电镜表征（Transmission Electron Microscopy,TEM）、扫描电镜表征（Scanning Electron Microscopy,SEM）、和Zeta电位对GO-C3N4-Pd复合纳米材料进行表征,向GO-C3N4-Pd复合纳米材料通入高压氢气30 min制得富氢GO-C3N4-Pd复合纳米材料,并通过亚甲基蓝检测其还原性和释氢能力;（4）设置对照组、实验组AD细胞模型,向实验组中分别加入富氢GO-C3N4-Pd复合纳米材料终浓度为20、60、200、600、2000μg/m L作用24 h后进行相关指标检测;（5）通过CCK-8检测对照组和实验组AD细胞模型的细胞存活率;（6）通过ROS、NO、SOD专用试剂盒对富氢GO-C3N4-Pd复合纳米材料处理后的AD细胞模型检测氧化指标ROS、NO和抗氧化酶SOD的含量;（7）通过JC-1探针对富氢GO-C3N4-Pd复合纳米材料处理后的AD细胞模型的线粒体膜电位进行检测。研究结果:（1）对NGF诱导第6天的PC12细胞经MAP2细胞免疫荧光和蛋白印迹进行验证,均表达MAP2蛋白,说明此时的细胞已经具备成熟神经元细胞的特点;（2）CCK8结果显示,与空白对照组相比,80μmol/m L、100μmol/m L的老化Aβ25-35处理PC12细胞的存活率分别为63.05%、46.60%（P<0.01）,在后续的实验中我们用80μmol/m L的Aβ25-35作用PC12细胞24 h构建AD细胞模型;（3）CCK-8检测结果显示:与对照组相比,2000ng/m L富氢GO-C3N4-Pd复合纳米材料能提高PC12细胞的存活率（P<0.05）;（4）ROS、NO、SOD专用试剂盒检测结果显示,2000 ng/m L富氢GO-C3N4-Pd复合纳米材料能有效降低ROS、NO的含量（P<0.05）,提高SOD的活力（P<0.05）;（5）2000 ng/m L富氢GO-C3N4-Pd复合纳米材料也能显著改善线粒体膜电位的下降,有效恢复线粒体功能（P<0.05）。结论:（1）未分化型PC12细胞经NGF诱导及在Cultrex Mouse Collagen IV的辅助下,分化为成熟神经元细胞,可以替代原代神经元细胞用于神经生物学和神经化学的研究;（2）老化Aβ25-35对PC12细胞具有损伤作用,导致细胞存活率下降,有氧化应激损伤作用,适用于构建AD细胞模型;（3）富氢GO-C3N4-Pd复合纳米材料可以降低老化Aβ25-35处理后PC12细胞内ROS、NO水平,提高SOD活力,降低细胞死亡率,改善线粒体膜电位,拮抗氧化应激带来的损伤,对PC12细胞有保护作用,有望进一步研究用于AD的治疗。
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