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目的:缺氧是许多临床常见疾病的共同病理生理过程,当机体尤其是心脏和大脑等重要器官遭受严重缺氧时甚至会导致死亡。氯化钴作为一个广为人知的缺氧模拟剂,它可以通过增加活性氧(Reactive oxygen species,ROS)产生、降低细胞活力、改变线粒体膜电位、激活Caspase-3和诱导凋亡产生缺氧/缺血性应答。转化生长因子-β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)是一种具有多种生物学活性的细胞外分泌型信号多肽,可以通过调节细胞的增殖、分化、黏附、移行及凋亡,在生物体的发育过程中发挥重要作用。TGF-β1在心脏保护中的作用也一直是研究的热点,诸多报道表明其在心肌细胞损伤中通常扮演抗凋亡的角色。大鼠ZFP580是由本组克隆的一种C2H2型锌指蛋白,前期研究表明TGF-β1可诱导其表达,且ZFP580在缺氧/复氧损伤诱导的H9c2心肌细胞损伤中具有促进细胞存活及抗凋亡等细胞保护作用。然而,ZFP580在H9c2心肌细胞缺氧损伤中是否具有类似作用及具体机制,以及是否受到TGF-β1的调控仍不清楚。本实验拟通过氯化钴处理H9c2心肌细胞建立化学缺氧诱导的细胞损伤模型,探究ZFP580在TGF-β1抗H9c2心肌细胞缺氧损伤保护效应中的作用及具体机制。方法:MTT法检测细胞存活率;Real time-PCR测定ZFP580和HIF-1α的m RNA表达水平;Western-blot检测ZFP580、HIF-1α、Smad2、Smad3、p-Smad2、p-Smad3、Bax、Bcl-2和Active Caspase-3的蛋白表达;Annexin V-FITC/PI法检测细胞凋亡;DCFH-DA检测活性氧生成;使用SB431542阻滞剂及慢病毒干扰技术后检测相关指标。结果:1氯化钴处理降低细胞存活率并上调ZFP580和HIF-1α的表达氯化钴可呈时间和剂量依赖方式降低细胞存活率。给予H9c2心肌细胞不同剂量的氯化钴(400、600、800、1000μM)处理24 h,细胞存活率随着氯化钴浓度的升高而降低,结果显示600μM氯化钴处理24 h时细胞存活率接近50%。然后使用600μM氯化钴分别处理细胞0、4、8、12、16、20和24 h,发现细胞存活率与对照组相比在8、12、16、20和24 h显著降低(P<0.05)。实时定量RT-PCR和Western blot的结果显示,氯化钴能在m RNA和蛋白水平促进ZFP580的表达,其m RNA表达高峰在12 h早于蛋白质表达水平的峰值16 h。而HIF-1α蛋白迅速积累且表达峰值在12 h,但在m RNA水平没有发现HIF-1α的显著改变。2 TGF-β1减弱氯化钴诱导的细胞毒性并上调ZFP580蛋白的表达为了进一步探讨在缺氧状态下TGF-β1的作用,在暴露于氯化钴相应时间前给予TGF-β1预处理。MTT实验结果表明与各自相对应的单纯缺氧组相比,TGF-β1预处理16 h和24 h明显减弱氯化钴诱导的细胞毒性,提高细胞存活率达到约10%(P<0.05)。Western blot结果显示常氧条件下TGF-β1刺激8、16和24 h后ZFP580的表达显著升高。同时,我们注意到暴露氯化钴处理前使用TGF-β1预处理也可以诱导ZFP580蛋白表达的上调。与各自相对应的单纯缺氧组相比,TGF-β1预处理8 h和24 h处ZFP580的表达上调明显改变,尤其是在24 h时间点处(P<0.05)。然而,在16 h时间点上,TGF-β1预处理的细胞与单纯缺氧的细胞之间没有观察到ZFP580表达的差别。3抑制Smad2/3的活化减弱ZFP580蛋白表达和TGF-β1介导的抗氯化钴诱导细胞凋亡的保护作用使用公认的TβR1-Smad2/3选择性抑制剂SB431542给予H9c2心肌细胞预处理,然后在暴露于氯化钴前予以TGF-β1刺激。结果表明SB431542能部分阻断TGF-β1诱导的ZFP580表达上调。另一方面,流式细胞术的结果表明,与单纯缺氧组相比,TGF-β1预处理可以显著降低的凋亡细胞的比例(P<0.05);与DMSO对照组相比,抑制Smad2/3的活化会使凋亡细胞的比例增加(P<0.05)。4 ZFP580在TGF-β1抗氯化钴诱导的细胞凋亡和ROS生成中的作用为了探讨ZFP580在抗氯化钴诱导的细胞凋亡TGF-β1/Smad2/3信号传导途径中的作用,我们通过转染ZFP580干扰慢病毒下调ZFP580的表达,然后在暴露于氯化钴前对细胞使用或不使用TGF-β1预处理。流式细胞仪结果表明,RNA干扰ZFP580组与阴性对照组相比,细胞凋亡比例显著增加(P<0.05);当转染过的细胞在暴露于氯化钴之前预先用TGF-β1处理,RNA干扰ZFP580抑制其表达会明显减弱TGF-β1的抗凋亡效果,凋亡细胞的比例显著增加(P<0.05)。共聚焦显微镜和酶标仪的结果表明,缺氧条件下RNAi-ZFP580组与阴性对照组相比,细胞的活性氧显著积累(P<0.05)。同时TGF-β1预处理可以减少氯化钴诱导的ROS生成。5 ZFP580通过抑制线粒体凋亡途径参与了TGF-β1的抗凋亡作用我们进一步探讨了ZFP580通过TGF-β1/Smad2/3信号传导途径抗氯化钴诱导细胞凋亡的具体机制。蛋白印迹的结果表明细胞预处理TGF-β1后,促凋亡分子Bax和活化的Caspase-3表达以及Bax/Bcl-2比率显著降低,抗细胞凋亡的分子Bcl-2表达显著增高(P<0.05)。同时,通过RNA干扰ZFP580抑制其表达后,TGF-β1的抗凋亡效果会被明显减弱,Bax/Bcl-2比率和活性Caspase-3的表达均显著增加(P<0.05)。结论:本研究中提供的实验证据表明,ZFP580可以作为缺氧环境下的新型调节分子。我们证实,ZFP580通过抑制线粒体凋亡途径在TGF-β1介导的抗化学缺氧诱导的细胞损伤中发挥重要的抗凋亡保护作用。