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目的:探讨结核分枝杆菌感染对小鼠巨噬细胞内胆固醇酯的影响;分析结核分枝杆菌感染的小鼠巨噬细胞内CH25H变化;构建CH25H过表达和干扰表达载体,研究CH25H对巨噬细胞内结核分枝杆菌生存的作用;预测分析CH25H的结构和功能。方法:(1)将小鼠RAW264.7细胞分为空白对照组,和结核分枝杆菌感染(菌量与细胞数之比分别为5:1、10:1、20:1)的实验组,孵育1 d、3 d、5 d和7 d后,采用油红O染色观察细胞内脂滴的变化;利用酶法测定细胞内胆固醇酯的相对含量的变化,采用CCK-8检测细胞的增殖水平。(2)将小鼠RAW264.7细胞分为空白对照组,和结核分枝杆菌感染(菌量与细胞数之比分别为5:1、10:1、20:1)的实验组,孵育3 d后,采用RT-PCR和ELISA检测细胞内CH25H的转录水平和蛋白水平的变化。电镜观察被感染细胞内细胞器结构的变化。(3)提取人外周血单核巨噬细胞的的总RNA,利用RT-PCR扩增出人CH25H基因。将p CD513B-1质粒和CH25H基因分别双酶切后进行连接,构建重组表达质粒,并将其转化进入大肠杆菌stabl3中,经氨苄抗性筛选和质粒的双酶切鉴定筛选阳性重组质粒,送公司测序。(4)按照CH25H基因的m RNA序列选择2条靶序列,根据每条靶序列按si RNA设计原则,各设计一对单链寡聚脱氧核苷酸,经缓慢退火形成对应的sh RNA的双链DNA,经双酶切后克隆入Pglv3/H1/GFP+Puro质粒,转化进入大肠杆菌stabl3中,送公司测序。测序正确后,大量扩增,提取质粒,备用。(5)将过表达和干扰表达重组质粒,转染进THP-1细胞,30 h后细胞内出现绿色荧光,表示转染成功。然后利用RT-PCR检测其表达水平。按照菌与细胞为10:1的比例感染转染成功的细胞,48 h后一部分进行抗酸染色,另一部分裂解后涂布罗氏培养基,观察CH25H对Mtb生存的影响。(6)应用生物信息学网站和软件分析CH25H蛋白的理化性质、信号肽、空间结构、抗原表位等。结果:(1)细菌数与细胞数之比为20:1孵育1 d,油红O染色细胞内可见大量脂滴,胆固醇酯相对含量为(65.91±2.45)%,孵育7 d,大量细胞出现裂解,脂滴溢出。细胞内胆固醇酯的含量随时间和菌量的增加而升高。(2)结核分枝杆菌感染所致的泡沫化巨噬细胞内CH25H在转录水平及蛋白水平都升高,且与细胞内结核分枝杆菌的量成正比。(3)CH25H过表达和干扰表达质粒,经公司测序,重组质粒构建成功。转染细胞30 h后,可观察到绿色荧光。经RT-PCR检测发现过表达组和干扰表达组,与空载组的灰度值比较P<0.05,有统计学意义。且与空白组相比,CH25H过表达组胆固醇酯的相对含量增加,干扰表达组胆固醇酯的相对含量降低。菌落计数发现过表达CH25H的细胞内细菌荷载量增加,干扰表达组的荷菌量降低,表示CH25H可以促进结核分枝杆菌的生长。(4)CH25H基因全长1 378 bp,编码272个氨基酸,为疏水性蛋白,含3个跨膜区域和6个磷酸化位点,属于不稳定性蛋白。结论:(1)结核分枝杆菌感染可以导致小鼠巨噬细胞内胆固醇酯含量增加,且与时间和菌量成正比。(2)结核分枝杆菌感染所致的泡沫巨噬细胞内CH25H在转录水平和蛋白水平均升高,且电镜发现随着细菌浓度的增加,细胞内细胞器结构病变逐渐加重,脂滴增加。(3)成功构建了CH25H过表达和干扰表达载体,且发现CH25H可以使细胞内胆固醇酯含量增加,促进结核分枝杆菌在巨噬细胞内的生存。(4)认识了CH25H基因及其编码蛋白的基本结构和功能。