论文部分内容阅读
目的：克隆绵羊肺腺瘤病毒受体hval-2基因全长,将其重组入原核表达载体中,构建重组质粒,进而转化到BL21(DE3)大肠杆菌中,进行诱导表达,利用亲和层析的方法纯化出Hyal-2蛋白,制备hyal-2的多克隆抗体,为进一步鉴定JSRV感染的组织细胞,探究JSRV的组织嗜性奠定基础.方法：本研究根据已报道的hval-2基因序列,经primer5.0软件设计一对特异性的引物序列,利用PCR方法扩增hval-2基因序列,并将其重组入pGEX-4T-1原核表达载体中,构建pGEX-4T-1-hyal-2重组质粒,进行菌液PCR及测序,鉴定重组质粒构建的正确性。将其转化到大肠杆菌BL21(DE3)中,经IPTG诱导后进行10%SDS-PAGE电泳分析,检测融合蛋白的表达情况,经Western blotting验证融合蛋白的表达。为了使GST-Hyal-2融合蛋白大量、稳定、高效地表达,本试验分别对重组菌表达GST-Hyal-2融合蛋白的IPTG诱导浓度、诱导时间、温度进行了优化,摸索最佳的表达条件。进而利用谷胱甘肽亲和层析的方法对目的蛋白进行亲和纯化,将纯化后的目的蛋白免疫家兔,制备Hval-2蛋白的多克隆抗体,经双向琼脂扩散实验测定多克隆抗体的效价,经Western blotting检测多克隆抗体的特异性。结果：利用PCR方法成功扩增出了hval-2基因片段,大小为1431bp,测序结果显示hval-2基因正确的插入到表达载体中,成功构建了pGEX-4T-1-hyal一2重组质粒。重组菌经IPTG诱导表达了相应预期大小的Hyal-2融合蛋白,蛋白大小为80ku,Western blotting也进一步验证了融合蛋白的表达。利用谷胱甘肽亲和层析的方法,纯化出了目的蛋白,利用Bradford法测得蛋白浓度为636.1μg/mL,与佐剂充分乳化后,免疫家兔,制备出了兔抗Hyal-2蛋白的多克隆抗体。双向琼脂扩散实验结果显示,多克隆抗体的效价达到了1：16,经Western blotting分析表明制备的多克隆抗体能够识别Hyal-2蛋白,且特异性较好。结论：成功构建了pGEX-4T-1-hyal-2重组质粒,并在BL21(DE3)中诱导表达出了Hyal-2蛋白,免疫家兔制备出了绵羊肺腺瘤病毒受体hyal-2的多克隆抗体。