论文部分内容阅读
传统真菌菌种鉴定方法主要以表型特征为依据，即通过培养后观察菌落形态和显微特征，或辅以生理、生化、营养实验，但结果易受多种因素影响，或出现不能鉴定的情况。因此迫切需要建立一种稳定、可靠的真菌菌种鉴定方法。本研究包括以下五部分内容：1．溶细胞酶结合Biospin真菌DNA提取试剂盒提取DNA收集实验室保存菌株和临床分离真菌株，用溶细胞酶（lyticase）结合Biospin真菌基因组DNA提取试剂盒提取基因组DNA，A260／A280检测纯度并计算质量浓度，经PCR扩增检验所提取的DNA质量，即采用真菌通用引物ITS1／ITS4扩增真菌核糖体RNA基因（ribosomal RNA gene, rDNA）内转录间区（internal transcribed spacers, ITS）。实验成功提取所有23株真菌基因组DNA，其纯度及质量浓度能满足PCR反应要求。用溶细胞酶结合Biospin真菌基因组DNA提取试剂盒可以从酵母菌、无绿藻及丝状真菌提取DNA，所提取DNA可进一步用于PCR反应。为核糖体RNA基因序列扩增及序列分析奠定了基础。2．草茎点霉的鉴定及超微结构研究形态学结合核糖体RNA内转录间区（internal transcribed spacers, ITS）核酸序列分析的方法，对上级部门下发的1株质控菌株进行鉴定；组织病理切片、扫描电镜及透射电镜观察孢子器结构。表型研究显示：该菌在37℃可生长，40℃不能生长。在燕麦培养基中生长可见黑色点状菌落及灰白色绒毛状菌丝，后期见棕红色色素扩散至培养基中。镜下见有孔的球形或透镜形的黑色分生孢子器及器孢子，鉴定为茎点霉（Phoma）；核糖体RNA基因（rDNA）内转录间区ITS序列分析，证明与草茎点霉（Phoma herbarum, P.herbarum）ATCC 22167 ITS区一致性为100％，鉴定为草茎点霉。超微结构见孢子从分生孢子器内壁产生。该研究显示：形态学是菌种鉴定的基础，形态学结合ITS区测序的方法，不仅可使该菌株的鉴定达到种的水平，同时两种方法的鉴定结果互相验证，以保证鉴定结果准确、可靠。3．祖菲无绿藻碳水化合物变种的鉴定及表型研究根据形态学、生化特征，对1株分离自脑膜炎患者的无绿藻菌株进行菌种鉴定。该菌在25℃、40℃均可生长，沙堡弱培养基（SDA）、马铃薯培养基（PDA）见光滑湿润的白色酵母样菌落，镜下圆形、椭圆形厚壁孢子及裂殖成的圆形或不规则形内孢子。无菌丝、无子囊、无芽孢，鉴定为无绿藻。API 20C AUX鉴定系统提示与威克汉姆无绿藻一致性为2.9％。选用不同引物进行PCR反应，扩增产物纯化后直接测序，通过核酸序列数据库进行同源性序列搜索及一致性比较鉴定菌种。NL1／NL4引物所扩增核糖体大亚基（LSU）26S rDNA D1／D2序列，与祖菲无绿藻碳水化合物变种（Prototheca zopfii var. hydrocarbonea）一致性为96％，提示祖菲无绿藻碳水化合物变种的可能性大；核糖体内转录间区ITS序列可能存在复杂结构，不适合该菌的测序鉴定；真核细胞核糖体小亚基（SSU）18S rDNA通用引物及无绿藻种属特异性引物PCR产物，同源性序列搜索，证明分离株与祖菲无绿藻碳水化合物变种18S rDNA有99.9％的碱基同源序列，故最终鉴定为祖菲无绿藻碳水化合物变种。形态学是菌种鉴定的基础，形态学结合核酸序列分析的方法，可使该菌株的鉴定达到种的水平，在所选择的测序片段中，SSU 18S rDNA比LSU 26S rDNA序列分析，更有利于该临床分离株的鉴定。4．真皮毛孢子菌的鉴定及生理、生化特征研究采用沙堡弱培养基多点接种法，从1例29岁男性患者病甲中，分离出一株酵母样菌，做形态及API 20 C AUX鉴定，PCR反应扩增核糖体RNA基因（rDNA）内转录间区（ITS）、基因间区1（intergenic spacer 1，IGS1）分析后，用BLAST软件分析法进行菌种鉴定。半定量Api-Zym系统分析细胞外酶活性。该菌株在37℃生长良好，40℃不能生长，镜下为关节孢子和真、假菌丝。尿素酶阳性，API 20 C AUX结果与粘质隐球菌（Cryptococcus humicolus）一致率78.9％，尚不能鉴定至种的水平。ITS、IGS1序列与GenBank公布的真皮毛孢子ITS和IGS1区一致率分别为99.8％和100％，鉴定为真皮毛孢子菌（Trichosporon dermatis）。Api-Zym细胞外酶活性试剂盒分析，碱性磷酸酶、酯酶、类脂酯酶、类脂酶、白氨酸芳胺酶、酸性磷酸酶、萘酚-AS-BI-磷酸水解酶、β-葡萄糖苷酶、N-乙酰-葡萄糖胺酶阳性。在形态学的基础上结合ITS、IGS1 rDNA序列分析可鉴定真皮毛孢子菌。多种酶活性可能与其致病有关。5．从1例声带感染组织内分离鉴定烟曲霉对一例曲霉所致的声带感染，进行包括直接镜检、培养、病理、镜下形态、温度耐受实验等真菌学研究及28S rDNA、ITS区测序等系列研究，将病原菌鉴定为烟曲霉（Aspergillus fumigatus）。在真菌致病物质研究中，真菌分泌性蛋白的致病作用引起人们的关注。随着蛋白质分析技术的发展，蛋白质的分离及鉴定成为可能。该研究包括以下几个内容：①制备甘氨酸为唯一氮源培养基，糠秕马拉色菌在其中生长，甘油及油酸两种脂源可以促进生长。②收集培养上清，通过牛奶培养基分析法，分析上清酶活性，根据培养基成分被分解而形成的透明带，推测培养上清具有一定蛋白酶或类似蛋白酶活性。③通过Api-Zym酶活性分析，显示不同培养条件下，细胞外酶类型有一定差异。其中生理盐水菌悬液检测出6种酶活性，包括不同种类的脂酶、白氨酸芳胺酶、酸性磷酸酶、萘酚-AS-BI-磷酸水解酶活性。在甘氨酸培养条件下，检测出类脂酯酶、酸性磷酸酶活性。在不同培养条件下，均未检测出胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶活性。④用Quanticleave蛋白酶分析法，检测到改良甘氨酸培养上清具有一定蛋白酶活性。加入BSA的改良甘氨酸培养上清，蛋白酶含量升高，提示培养基中的蛋白成分可诱导蛋白酶产生。⑤改良甘氨酸培养上清TCA沉淀后，经SDS-聚丙酰胺电泳进行蛋白初步分离，显示5条带，其中30 KD左右有两条带，丰度高。生理盐水菌悬液经超滤浓缩，SDS-聚丙酰胺电泳进行蛋白初步分离，显示5条带。但某些条带的分子量与改良甘氨酸上清来源的条带不同。