目的:现在对疼痛学的研究,P2受体一直受广大科学家关注^[1]。在P2受体内,包含P2X和P2Y两类,其中本文研究的P2X7受体就是P2X中受体的一种。P1受体和蛋白酶活化受体PARs,均是G蛋白偶联受体（G-protein couled receptor,GPCR）的家族成员之一。据最新的研究发现,PARs中包括四种亚型。这四种亚型,分别是PAR1、PAR2、PAR3、PAR4。在疼痛和炎症的信号调节研究中,蛋白酶能够使GPCR N-末端裂解,让受体形成新N-末端。新N-末端形成后的受体连接并激活自身,施展蛋白酶激活受体自身调节疼痛及炎症过程的作用。一氧化氮合酶（NOS）,属于一种同工酶,在内皮细胞、巨噬细胞、神经细胞内存在,分为神经型一氧化氮合酶、诱导型一氧化氮合酶、内皮型一氧化氮合酶。一氧化氮合酶在许多生理过程中发挥作用,当组织出现炎性刺激后,肥大细胞内的一氧化氮合酶表达增加。但是,对于PAR4活化后调节机制的整个机体的炎性过程,还不是很清楚。尤其是对PARs、P2X、NOS受体,在凝血酶、类胰蛋白酶、胰蛋白酶的激活下,对于胃肠道疾病的影响,依然成为现在科研人员的研究热点^[2]。科学家的进一步的探索、研究,能为疼痛和炎症的新治疗方法,提供一个全新的科研领域。本课题,通过使用内脏高敏感性大鼠为实验模型,通过调整PAR4受体在生物体内的活化程度,以及人为对PAR4受体对肥大细胞的影响的干预,探究PAR4受体对胃肠道功能的作用及影响,对炎性因子如NOS、PAR4、P2X7等表达干预作用。实验成果能够为肠易激综合征（IBS）患者,提供更有效的治疗手段。材料方法:1.通过使用CRD建模方式,对成年SD大鼠使用直结肠扩张技术。创立实验需要的IBS大鼠实验模型,并对动物模型内的大鼠评分。评分采用AWR的评分标准,使用半定量方法,评分合格的动物,成为IBS的动物模型。对合格的动物模型,使用动物机能实验仪器检测。检测仪器采用BL420-F系统,对腹部肌肉进行腹部肌肉肌电图检测,观察肌肉动度。2.建立IBS组动物实验模型,给予IBS组大鼠,肛门内灌注PAR4激动剂（PAR4-AP）,采用半定量的方法进行AWR评分。3.动物模型设计好后,提取大鼠肠组织,使用免疫组织化学方法,结合甲苯胺蓝染色技术,观察肥大细胞在IBS组大鼠模型、正常大鼠模型以及注入PAR4-AP的IBS大鼠三组模型内肠粘膜的变化,以及对NOS、P2X7、PAR4的影响。镜下观察大鼠肠组织内,经过活化的PAR4,对肥大细胞NOS和P2X7表达变化的影响。采用免疫印迹实验（WB）技术,半定量测定,通过灰度值比较,对三个组数据行统计学计算,验证差异有无统计学意义。4.使用免疫组织化学技术,联合应用激光共聚焦显微镜观察方法,Tryptase（类胰蛋白酶,AA4,是肥大细胞的特异性标志物）和PAR4、P2X7、NOS在实验动物肠组织结构中的联系。进一步观察活化后的PAR4对P2X7、NOS呈阳性表达的肥大细胞间的关系。5.提取正常组、IBS组、PAR4激动剂组内,三组SD大鼠的背根神经节,使用IHC方法上色,观察MC。并进一步观察PAR4受体在神经组织内的变化。结果:1、经过活化的PAR4受体,对IBS大鼠模型的腹痛作用。（1）采用CRD技术扩张大鼠直肠,我们发现IBS组内的SD大鼠,AWR结果明显偏高,说明经过直肠扩张处理后,鼠内脏高敏感性升高。PAR4激动组内的SD大鼠,AWR评分结果较IBS组偏低,说明大鼠模型经过加入PAR4激动剂后,内脏高敏感性能够被人为降低^[3]。（2）大鼠模型通过腹部肌肉肌电图检测,结果显示在IBS组大鼠模型体内,注入PAR4激动剂,能够明显降低因为直肠扩张引起的肌电图平均峰值,使峰值的曲线面积减少。2、经过活化的PAR4受体,对IBS组大鼠模型P2X7和NOS呈阳性肥大细胞的影响。（1）对于PAR4呈阳性细胞表达的影响。IBS组盲肠组织的切片内,提取相应蛋白质,在免疫印迹实验内,半定量测定得出的灰度值进行比较,PAR4阳性细胞数量明显高于PAR4激动组和正常组。PAR4激动组内显示阳性反应的肥大细胞,数量高于正常组。（2）PAR4活化对肥大细胞的影响。在IBS组盲肠组织切片内,我们发现AA4呈阳性的肥大细胞数目,比正常组和PAR4激动组的阳性细胞数目,显著增加。（3）PAR4活化对NOS阳性细胞的影响。在IBS组盲肠组织内,提取相应蛋白质,在免疫印迹实验内,半定量测定得出的灰度值进行比较,NOS显示呈阳性的细胞计数,相对于正常组,细胞数量增高。经过PAR4激动剂处理后的实验组,NOS显示为阳性的肥大细胞计数,比正常组的计数多.（4）免疫印迹实验技术,灰度值同样显示,PAR4活化后对P2X7呈阳性表达的细胞数目变化。正常组和PAR4组内,P2X7阳性细胞计数明显低于IBS组,正常组低于PAR4激动组。3、在IBS组大鼠模型内,PAR4、P2X7和NOS在肥大细胞内的表达变化。使用免疫组织化学方式,联合应用激光共聚焦显微镜技术,在显微镜下观察发现通过骨髓干细胞诱导培育的肥大细胞以及IBS组大鼠肠粘膜内的肥大细胞,均表达PAR4、P2X7和NOS。并且PAR4、P2X7和NOS同AA4共同存在。4、提取正常组、IBS组、PAR4激动剂组,三组SD大鼠的背根神经节。将提取的神经节使用免疫组织化学方法染色,发现NOS、P2X7染色呈阳性表达的细胞,IBS组和PAR4激动组明显增多,且IBS组阳性肥大细胞数目,明显高于PAR4激动组。结论:1、对于AWR评分较高的IBS组大鼠,内脏高敏感性偏高,然而加入一定剂量的PAR4激动剂,可以对这种内脏高敏感性起到一定程度的抑制作用。2、正常组和PAR4激动组内的肥大细胞（MC）,相比于IBS组,细胞个数降低。正常组内的肥大细胞数量比PAR4激动组内的个数还要低。3、在内脏高敏感性腹痛的调节过程中,P2X7经过肥大细胞来介导,并且能通过PAR4和NOS因子共同来实现的,PAR4和NOS反过来对肥大细胞的炎性反应,起调节作用^[4]。4、PAR4、P2X7、NOS通过调节背根神经元,间接参与到内脏高敏感性腹痛的调节过程。