目前,随着我国养猪业集约化、规模化的空前发展,细菌病的频发造成了抗生素的滥用,导致动物机体病原菌耐药性增强和畜产品中药物残留等问题,影响着养猪业的生产发展和人类健康,益生菌作为抗生素的替代品由此应运而生,其中乳酸菌是一类主要的益生菌,能够抑制有害菌生长、调节动物胃肠道功能以及促进动物机体生长,逐步成为当前研究的热点。此外,细菌生物被膜作为细菌自身的一种保护性生长方式,能够增强对外界环境的抵抗力,有报道称生物被膜态下益生菌制备的饲料添加剂具有更强的耐热性、耐酸性以及抗冷冻和干燥能力,但国内外关于益生菌生物被膜的研究相当匮乏,尚处于起步阶段。本研究采用平板涂布法分离猪粪便中的乳酸菌,经形态学观察和生理生化鉴定初步筛选出108株革兰阳性、触酶阴性的疑似乳酸菌,分别采用牛津杯法和结晶紫染色法测定抑菌特性和生物被膜形成能力,结果显示,有5株分离株同时具有抑菌特性和生物被膜形成能力,经16S rDNA分子生物学鉴定,其中4株为约氏乳杆菌(L-8、L-11、L-18、L-76),1株为嗜淀粉乳杆菌(L-102)。为获得益生性乳酸菌,分别检测其产酸能力,对pH、胆盐、胰蛋白酶、高温的耐受性,细胞黏附性,广谱抑菌性,药物敏感性,生长活性以及安全性等生物学特性,结果显示,培养24h后各菌株上清液pH值均在4.10~4.40之间;在pH 2.0环境下,随时间的延长,L-8、L-11和L-18菌液中活菌数下降,L-76和L-102菌液中活菌数基本无变化;经0.4%胆盐处理后,L-76和L-102菌液中活菌数分别可达10~3 CFU/ml和10~4CFU/ml,而L-8、L-11、L-18几乎不能存活;经胰蛋白酶处理后,各菌株均生长正常;经测试,5株乳酸菌对猪小肠上皮细胞的黏附率均在77.04%~79.76%之间,且对大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌和维氏气单胞菌等病原菌均有抑制性;于60℃下作用15min后,L-8菌液中活菌数下降至10~4CFU/ml,L-11、L-18、L-76和L-102菌液中活菌数仍可达到10~7CFU/ml;在药物敏感性试验中,L-76和L-102对8种药物表现为耐药,耐药性相对于L-8、L-11、L-18较强;在生长曲线测试中,L-76于培养5h后进入对数期,生长速度相对略快。综上研究表明,上述5株乳酸菌均具有一定的产酸性、胰蛋白酶耐受性、细胞黏附性、广谱抑菌性以及生长活性,其中L-76和L-102生物学特性相对良好;通过模拟动物急性中毒实验,结果显示,分别灌胃和腹腔注射10~8 CFU/ml L-76和L-102菌液后,小鼠生长状态正常,表明L-76和L-102均具有一定安全性。本试验进一步研究被膜态和浮游态下乳酸菌L-76和L-102上清液对病原菌的抑菌活性,结果显示,被膜态和浮游态乳酸菌上清液分别与病原菌共培养后,病原菌的生长均被抑制;经不同pH(3.0、5.0、7.0、9.0)、酶(过氧化氢酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶、蛋白酶K)以及温度(40、50、60、70、80℃)处理两种状态下乳酸菌上清液,检测对病原菌的抑制作用,结果显示,随pH值增大,被膜态和浮游态乳酸菌L-76、L-102上清液对指示菌的抑菌圈直径均减小,表明其抑菌活性下降,且当pH为7.0和9.0时,均无抑菌活性;经过氧化氢酶和不同温度作用后,被膜态和浮游态乳酸菌L-76、L-102上清液对指示菌的抑菌圈直径变化差异不显著,表明过氧化氢酶和温度对两种状态下乳酸菌上清液的抑菌活性影响较小;经蛋白酶作用后,两种状态下L-76和L-102上清液对指示菌的抑菌圈直径均明显减小,且与浮游态相比,被膜态乳酸菌上清液对指示菌的抑菌圈直径更小,表明蛋白酶对被膜态乳酸菌上清液的抑菌活性影响较大。综上可见,两种状态下乳酸菌上清液具有pH依赖性、温度和过氧化氢酶稳定性以及蛋白酶敏感性,且与浮游态相比,被膜态乳酸菌上清液的抑菌活性对蛋白酶更敏感,分析被膜态和浮游态乳酸菌上清液的抑菌成分中可能含有有机酸、蛋白、多肽等物质,且被膜态乳酸菌上清液中的抑菌物质活性或含量高于浮游态。经扫描电镜观察研究两种状态下乳酸菌L-76和L-102上清液对病原菌的抑制作用,结果表明,共培养后病原菌形态发生改变甚至裂解死亡,且与浮游态相比,被膜态乳酸菌上清液对指示菌形态影响更大,证明两种状态下乳酸菌上清液中均含有抑菌物质,且被膜态乳酸菌上清液中的抑菌物质活性略高或含量略多。