论文部分内容阅读
目的：观察兔骨髓间充质干细胞(BMSCs),经转化生长因子-β1 (TGF-β1)等向软骨细胞诱导8d、11d、14d、17d、20d后,与藻酸钙凝胶复合体外培养,细胞在三维条件下增殖情况及共同构建组织工程化软骨情况.方法：穿刺新西兰大耳白兔股骨抽取骨髓,密度梯度离心法分离、培养BMSCs.将传至第3代的BMSCs予以含TGF-β1、地塞米松等成份的无血清诱导液定向向软骨细胞诱导.根据不同的诱导时间,实验组分成为A、B、C、D、E5组：A组：诱导至第8d；B组：诱导至11d；C组：诱导至14d；D组：诱导至17d；E组：诱导至20d.通过细胞形态、TB染色、Ⅱ型胶原免疫组化、培养液内多聚蛋白聚糖(AG)含量,比较各实验组定向诱导成软骨细胞情况.分别将以上各组成软骨细胞复合藻酸钙凝胶,以1×107/ml的密度制作为细胞-藻酸钙凝胶珠,继续体外培养14d.培养过程中观察细胞在藻酸钙凝胶中生长、增殖情况,并通过Ⅱ型胶原免疫组化、阿利新蓝比色法测定各组Ⅱ型胶原表达和多聚蛋白聚糖(AG)的含量,综合比较各实验组构建组织工程化软骨的情况.结果：密度梯度离心法分离纯化的BMSCs定向成软骨细胞诱导8d时形态有较明显改变,14d时具有明显的软骨细胞形态.诱导培养液在诱导4d时即可检出少量AG,8d时AG浓度出现明显升高,并保持缓慢升高至20d.在14d时,诱导的细胞爬片TB染色可见异染颗粒；Ⅱ型胶原免疫组化明显阳性表现.与藻酸钙复合后,各组成软骨细胞在凝胶3D支架中均保持分裂增殖,AO染色见细胞能增殖成"葡萄串"样.各实验组材料切片Ⅱ型胶原免疫组化均可见阳性表达,以C组、D组为明显；AG含量检测显示各实验组、阳性对照组间AG含量具有差异(p＜0.05),C组、D组均高于阳性对照组,以C组AG含量为最高.结论：1.采用密度梯度离心法获取的兔BMSCs,在体外经过14d的定向诱导后基本向软骨细胞分化；2.藻酸钙凝胶与种子细胞生物相容性良好,可以采用注射方式植入；诱导14d后的成软骨细胞在藻酸钙凝胶内增殖良好,分泌软骨细胞外基质功能较强.以BMSCs为种子细胞、藻酸钙为支架的可注射式软骨组织工程方法具有可行性.