【摘 要】
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MBP(甘露糖结合蛋白)是一种存在于中华绒螯蟹血清中的c型凝集素.MBP通过结合病原生物表面的甘露糖等糖基受体调节吞噬作用,在机体的固有免疫应答过程中发挥重要作用.为了研究其在侵染及免疫方面的功能,克隆了MBP这个基因,分析核酸序列可知其全长为1154bp,开放阅读框(ORF)为915bp,编码304个氨基酸,并将MBP重组蛋白在大肠杆菌BL21表达载体中表达,以纯化后的MBP重组蛋白作为抗原免疫
【机 构】
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南京师范大学生命科学学院水生甲壳动物疾病重点实验室,江苏省生物多样性和生物技术重点实验室,中国江苏省南京市栖霞区仙林街道文苑路1号,210023
【出 处】
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第十届世界华人虾蟹养殖研讨会暨2016年中国河蟹产业发展高峰论坛
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MBP(甘露糖结合蛋白)是一种存在于中华绒螯蟹血清中的c型凝集素.MBP通过结合病原生物表面的甘露糖等糖基受体调节吞噬作用,在机体的固有免疫应答过程中发挥重要作用.为了研究其在侵染及免疫方面的功能,克隆了MBP这个基因,分析核酸序列可知其全长为1154bp,开放阅读框(ORF)为915bp,编码304个氨基酸,并将MBP重组蛋白在大肠杆菌BL21表达载体中表达,以纯化后的MBP重组蛋白作为抗原免疫新西兰兔制备多克隆抗体,采用间接ELISA法检测抗血清的效价.之后通过Far-Western Blotting技术筛选MBP与螺原体的互作蛋白,质谱分析与螺原体互作的蛋白有Mreb3和SLP蛋白.Mreb3蛋白是中华绒螯蟹螺原体的骨架蛋白,该蛋白有维持螺原体独特的螺旋细胞结构的作用.本实验克隆了Mreb3这个基因,分析核酸序列可知其开放阅读框(ORE)为1059bp,编码352个氨基酸,并将Mreb3重组蛋白在大肠杆菌BL21表达载体中表达,得到约39KDa的重组蛋白,并进行了多克隆抗体的制备和效价检测.SLP是中华绒螯蟹螺原体的类螺旋蛋白,基于本课题组对SLP的研究,表明SLP可以引起宿主一系列免疫反应,包括免疫相关基因的明显表达和蛋白激酶磷酸化水平的提高等.再次通过Far-Western Blotting技术,验证螺原体刺激中华绒螯蟹时,SLP和Mreb3蛋白是否与中华绒螯蟹的MBP蛋白发生互作,结果表明,两者均与中华绒螯蟹的MBP蛋白发生互作.为了进一步验证MBP与Mreb3以及SLP之间的相互作用,本研究拟进行免疫共沉淀、激光共聚焦实验、交叉中和实验、过表达及DSRNA干扰技术研究互作蛋白的功能.通过以上实验拟阐明螺原体在侵染中华绒螯蟹血细胞过程中MBP与SLP以及Mreb3之间存在相互作用.
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微生物普遍存在于健康的甲壳动物血淋巴中,而对血淋巴中微生物菌群丰度的计数缺乏准确的方法.本研究开发一种基于荧光显微术和过滤原理来计数甲壳动物血淋巴微生物丰度的方法,该方法用荧光显微镜直接观察计数微生物,并可以有效去除血淋巴中的血细胞对微生物细胞计数的干扰.与目前报道较多的微生物平板菌落计数法和稀释培养计数法相比具有更高的准确性.本研究以健康拟穴青蟹为对象,为了减少外界环境及不同的食物来源对青蟹血淋
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