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摘 要：对原生质体融合技术的关键步骤、影响原生质体融合和分离的因素进行了综述。就原生质体融合技术在微生物育种技术上的应用前景进行了分析。
关键词：原生质体融合;菌种选育
原生质体融合（Protoplast fusion）技术起源于20世纪60年代。1960年法国Karski研究小组在两种不同类型的动物细胞混合培养中发现了自发融合现象。1974年，匈牙利Ferenczy报道了白地霉（Geotrichum candidum）的营养缺陷型突变株的原生质体的融合。从而使原生质体融合技术成为微生物育种的一项新技术。1979年匈牙利的Pesti首先报道融合育种提高青霉素产量，原生质体融合技术成为改良工业菌株的手段之一。本文综述原生质体融合技术在微生物菌种选育中的应用。
一、原生质体融合技术
各类不同的微生物，显然它们的形态，结构不同、遗传特性各异，生理代谢类型差异也很大，但对它们制备原生质体，并对其进行融合的程序有类似之处，原生质体融合的关键步骤也是基本一致的。微生物原生质体融合技术的基本程序包括：原生质体的制备与形成、原生质体融合与融合子形成、原生质体或融合子再生、正变融合子的筛选与保藏。
1.1原生质体融合的关键步骤
为了实现原生质体的融合，除去遗传物质交换重组的屏障，首先必须使亲株原生质体化，以便很好地制备原生质体，这是提高原生质体的再生率与融合率的基础。因此，原生质体化是原生质体融合的第一个关键步骤，同时，它也是保证实现各类原生质体技术的第一个关键步骤。
其次，融合后的原生质体必须顺利地再生出细胞壁，进而形成完整的营养体细胞，才可能顺利地筛选出稳定的高产重组子。而且再生率愈高则筛选出正变菌株的机率和可能性也愈大。因此，提高再生率则是原生质体融合的另一关键步骤。
融合条件也是不可忽视的，因为只有通过这一环节才能实现遗传物质的交换与重组，形成融合子与稳定重组子。只不过相对来说，前两个环节更为关键而已。
1.2影响原生质体融合的因素
影响原生质体融合率的因素有很多，除了影响原生质体制备与原生质体再生的因素均与融合率有关以外，原生质体融合的聚合剂种类、剂量、型号以及融合处理的条件（如渗透压、离子种类浓度、pH值、温度、时间）等，也都会直接影响到原生质体的融合率。
1.3影响原生质体分离的因素
⑴培养基成分
培养基成分的改变，直接或间接地影响着细胞壁的状况，对原生质体的释放量也有显著影响。李东屏等分别曾用5种培养基培养草菇和银丝草菇（V.bom-bycina）的菌丝，制备原生质体。研究发现CYM培养基适合银丝草菇分离原生质体。用CYM、PDA、PMA及PQA4种培养基培养糙皮侧耳（Pleurtus ostreatus）的次生菌丝体，分离原生质体时，原生质体数有明显差别。用平菇子实体浸出液所配的PQA培养基对糙皮侧耳原生质体释放的效果最佳。草菇和银丝草菇都属于小包脚菇属（V olvariella）的真茵，对培养基的要求则有所不同，PDA+10%稻草浸煮液培养草菇较好，CYM培养基培养银丝草菇效果较好。
⑵溶壁酶
用酶法破壁制备原生质体，酶的作用无疑是关键的。不同种类真菌的细胞壁成分和结构是不同的，鞭毛菌亚门是以纤维素和β-葡聚糖为主要成分;接合菌亚门是以脱乙酰几丁质为主要成分;子囊菌亚门（半子囊菌除外）和担子菌亚门则以几丁质、β-葡聚糖为主。同一种真菌的不同发育时期或不同菌态的细胞壁成分不同，因此分离原生质体时，不同的真菌、同一种真菌的不同发育时期、不同培养方式，对溶壁酶的种类和浓度要求有所不同。
⑶渗透压稳定剂
渗透压稳定剂对原生质体的形成之所以重要，在于其在菌丝与酶这样一个反应系统中起着一种媒介物的作用。首先，渗透压稳定剂的浓度是维持和控制原生质体数量的重要因素。它使菌丝细胞内外压力一致，使菌丝细胞保持生理状况的稳定，原生质体完整地释放出来，且保持原生质体不破裂也不收缩。其次，渗透压稳定剂的性质影响着裂解酶的反应活性。不同的裂解酶需要不同性质的渗透压稳定剂才能得到最佳的效果。
⑷菌龄
菌丝体的菌龄对原生质体释放的影响主要由于壁的成分和结构的变化引起。菌龄短的菌丝体的壁成分相对简单，壁也相对薄些;随着菌龄增加，壁上沉积色素等次生物质，酶的作用相对困难些，壁难以被溶解。但菌龄过短，又会造成菌丝量不足，或影响原生质体的再生。不同种类的真菌对酶解时最佳菌龄是不同的。
二、应用
原生质体融合技术在微生物育种中的应用已经相当广泛，应用范围主要包括以下几方面。
2.1改良菌种遗传特性
酿酒酵母是酿酒生产的菌种，在发酵后期，那些能凝集并形成絮状的酵母称凝集性酵母，而那些沉淀性不好的酵母称为粉状酵母。具有良好凝集性的酵母可使酿酒发酵液澄清速度加快，降低酵母分离时的能量消耗，并且还可防止酵母在发酵液中长时间悬浮，导致细胞自溶而影响啤酒的风味。酿酒酵母的凝集特性由其本身的遗传特性决定，一般凝集性较好的酿酒酵母往往发酵度偏低。如果应用原生质体融合技术就能选育出具有较高的发酵度又具有较强的凝集性的融合重组菌株。
2.2优化菌种发酵特性
许多种微生物能在45-65℃生存，有的甚至更高。有的耐热菌可在98℃的温泉中生长繁殖。这种耐热特性在工业上具有很重要的应用价值。如在酒精酿造中，酿酒酵母在40℃时产酒率明显下降，要降低发酵液的温度，必须消耗大量能源。因此，将酿酒酵母396（能利用甘蔗糖蜜生产酒精）和假丝酵母C6（45℃生长良好）原生质体融合，筛选得到在40℃条件下培养，原料利用率达94.3%，乙醇产量为59.7g/L的属间融合株。
2.3质粒转移
微生物可通过转化、转导、接合和转染等多种方式传递遗传信息，但有些微生物不具备这些条件，它们的遗传物质传递研究和育种工作皆受到一定的限制。由于原生质体融合可在种内、种间甚至更为远缘之间进行，因而通过原生质体融合有可能将质粒转移到非感受态菌株中，为基因转移和育种提供了新的途径。
2.4原生质体与细胞核融合
现在还发展了细胞核与原生质体融合的方法，实现细胞核的直接转移。该法首先制备营养缺陷型亲株的原生质体，然后使其在低渗溶液中破裂而释放出细胞核，通过蔗糖密度梯度离心，收集细胞核。将细胞核与受体菌原生质体混合，在PEG和Ca2+存在下进行融合，分离到基本培养基上选择融合子。这一转移机制为：在PEG和Ca2+存在条件下，受体菌原生质体在融合过程中，随着细胞膜的融合，捕获了供体菌的细胞核并将其摄入原生质体中。应用这一技术可研究核与核，以及核与胞质之间的相互关系，并为育种工作提供了新的模式。
2.5原生质体融合技术在其它微生物育种方面的应用
裘娟萍等以原生质体融合技术构建廣谱抗噬菌体菌株。通过原生质体融合技术还可对耐热机理进行研究。如有一株耐高温酵母一旦经EB诱变失去线粒体变为小菌落后，即失去耐高温特性。说明耐热性与线粒体有关系。因而应用原生质体技术对耐热性的转移和对耐热机理进行研究将是一条途径。蒋文泓等以禽多杀性巴氏杆菌5A弱毒菌株与禽大肠杆菌02弱毒菌株作亲本，进行原生质体融合后再生，成功地获得3株具有双亲本耐药性和双菌体血清型的融合菌株，试图获得具多种疾病免疫力的疫苗生产菌株。
结论
原生质体融合技术作为遗传育种的一个有效手段，已广泛应用于微生物育种工作的各个方面。但是还都只局限于两个菌之间的融合，没有扩展到3个以上的菌之间的融合，如果能开展多个菌之间的融合，则有可能获得同时具多个优良性状的菌株，进一步拓宽应用面。
参考文献
[1]裘娟萍，王普.虾青素高产菌种的选育[J].工业微生物，2001，31（2）：5-9.
[2]蒋文泓，黄青云.禽多杀性巴氏杆菌与大肠杆菌科间原生质体融合的研究[J].畜牧兽医学报，1999，30（3）：267-272.
关键词：原生质体融合;菌种选育
原生质体融合（Protoplast fusion）技术起源于20世纪60年代。1960年法国Karski研究小组在两种不同类型的动物细胞混合培养中发现了自发融合现象。1974年，匈牙利Ferenczy报道了白地霉（Geotrichum candidum）的营养缺陷型突变株的原生质体的融合。从而使原生质体融合技术成为微生物育种的一项新技术。1979年匈牙利的Pesti首先报道融合育种提高青霉素产量，原生质体融合技术成为改良工业菌株的手段之一。本文综述原生质体融合技术在微生物菌种选育中的应用。
一、原生质体融合技术
各类不同的微生物，显然它们的形态，结构不同、遗传特性各异，生理代谢类型差异也很大，但对它们制备原生质体，并对其进行融合的程序有类似之处，原生质体融合的关键步骤也是基本一致的。微生物原生质体融合技术的基本程序包括：原生质体的制备与形成、原生质体融合与融合子形成、原生质体或融合子再生、正变融合子的筛选与保藏。
1.1原生质体融合的关键步骤
为了实现原生质体的融合，除去遗传物质交换重组的屏障，首先必须使亲株原生质体化，以便很好地制备原生质体，这是提高原生质体的再生率与融合率的基础。因此，原生质体化是原生质体融合的第一个关键步骤，同时，它也是保证实现各类原生质体技术的第一个关键步骤。
其次，融合后的原生质体必须顺利地再生出细胞壁，进而形成完整的营养体细胞，才可能顺利地筛选出稳定的高产重组子。而且再生率愈高则筛选出正变菌株的机率和可能性也愈大。因此，提高再生率则是原生质体融合的另一关键步骤。
融合条件也是不可忽视的，因为只有通过这一环节才能实现遗传物质的交换与重组，形成融合子与稳定重组子。只不过相对来说，前两个环节更为关键而已。
1.2影响原生质体融合的因素
影响原生质体融合率的因素有很多，除了影响原生质体制备与原生质体再生的因素均与融合率有关以外，原生质体融合的聚合剂种类、剂量、型号以及融合处理的条件（如渗透压、离子种类浓度、pH值、温度、时间）等，也都会直接影响到原生质体的融合率。
1.3影响原生质体分离的因素
⑴培养基成分
培养基成分的改变，直接或间接地影响着细胞壁的状况，对原生质体的释放量也有显著影响。李东屏等分别曾用5种培养基培养草菇和银丝草菇（V.bom-bycina）的菌丝，制备原生质体。研究发现CYM培养基适合银丝草菇分离原生质体。用CYM、PDA、PMA及PQA4种培养基培养糙皮侧耳（Pleurtus ostreatus）的次生菌丝体，分离原生质体时，原生质体数有明显差别。用平菇子实体浸出液所配的PQA培养基对糙皮侧耳原生质体释放的效果最佳。草菇和银丝草菇都属于小包脚菇属（V olvariella）的真茵，对培养基的要求则有所不同，PDA+10%稻草浸煮液培养草菇较好，CYM培养基培养银丝草菇效果较好。
⑵溶壁酶
用酶法破壁制备原生质体，酶的作用无疑是关键的。不同种类真菌的细胞壁成分和结构是不同的，鞭毛菌亚门是以纤维素和β-葡聚糖为主要成分;接合菌亚门是以脱乙酰几丁质为主要成分;子囊菌亚门（半子囊菌除外）和担子菌亚门则以几丁质、β-葡聚糖为主。同一种真菌的不同发育时期或不同菌态的细胞壁成分不同，因此分离原生质体时，不同的真菌、同一种真菌的不同发育时期、不同培养方式，对溶壁酶的种类和浓度要求有所不同。
⑶渗透压稳定剂
渗透压稳定剂对原生质体的形成之所以重要，在于其在菌丝与酶这样一个反应系统中起着一种媒介物的作用。首先，渗透压稳定剂的浓度是维持和控制原生质体数量的重要因素。它使菌丝细胞内外压力一致，使菌丝细胞保持生理状况的稳定，原生质体完整地释放出来，且保持原生质体不破裂也不收缩。其次，渗透压稳定剂的性质影响着裂解酶的反应活性。不同的裂解酶需要不同性质的渗透压稳定剂才能得到最佳的效果。
⑷菌龄
菌丝体的菌龄对原生质体释放的影响主要由于壁的成分和结构的变化引起。菌龄短的菌丝体的壁成分相对简单，壁也相对薄些;随着菌龄增加，壁上沉积色素等次生物质，酶的作用相对困难些，壁难以被溶解。但菌龄过短，又会造成菌丝量不足，或影响原生质体的再生。不同种类的真菌对酶解时最佳菌龄是不同的。
二、应用
原生质体融合技术在微生物育种中的应用已经相当广泛，应用范围主要包括以下几方面。
2.1改良菌种遗传特性
酿酒酵母是酿酒生产的菌种，在发酵后期，那些能凝集并形成絮状的酵母称凝集性酵母，而那些沉淀性不好的酵母称为粉状酵母。具有良好凝集性的酵母可使酿酒发酵液澄清速度加快，降低酵母分离时的能量消耗，并且还可防止酵母在发酵液中长时间悬浮，导致细胞自溶而影响啤酒的风味。酿酒酵母的凝集特性由其本身的遗传特性决定，一般凝集性较好的酿酒酵母往往发酵度偏低。如果应用原生质体融合技术就能选育出具有较高的发酵度又具有较强的凝集性的融合重组菌株。
2.2优化菌种发酵特性
许多种微生物能在45-65℃生存，有的甚至更高。有的耐热菌可在98℃的温泉中生长繁殖。这种耐热特性在工业上具有很重要的应用价值。如在酒精酿造中，酿酒酵母在40℃时产酒率明显下降，要降低发酵液的温度，必须消耗大量能源。因此，将酿酒酵母396（能利用甘蔗糖蜜生产酒精）和假丝酵母C6（45℃生长良好）原生质体融合，筛选得到在40℃条件下培养，原料利用率达94.3%，乙醇产量为59.7g/L的属间融合株。
2.3质粒转移
微生物可通过转化、转导、接合和转染等多种方式传递遗传信息，但有些微生物不具备这些条件，它们的遗传物质传递研究和育种工作皆受到一定的限制。由于原生质体融合可在种内、种间甚至更为远缘之间进行，因而通过原生质体融合有可能将质粒转移到非感受态菌株中，为基因转移和育种提供了新的途径。
2.4原生质体与细胞核融合
现在还发展了细胞核与原生质体融合的方法，实现细胞核的直接转移。该法首先制备营养缺陷型亲株的原生质体，然后使其在低渗溶液中破裂而释放出细胞核，通过蔗糖密度梯度离心，收集细胞核。将细胞核与受体菌原生质体混合，在PEG和Ca2+存在下进行融合，分离到基本培养基上选择融合子。这一转移机制为：在PEG和Ca2+存在条件下，受体菌原生质体在融合过程中，随着细胞膜的融合，捕获了供体菌的细胞核并将其摄入原生质体中。应用这一技术可研究核与核，以及核与胞质之间的相互关系，并为育种工作提供了新的模式。
2.5原生质体融合技术在其它微生物育种方面的应用
裘娟萍等以原生质体融合技术构建廣谱抗噬菌体菌株。通过原生质体融合技术还可对耐热机理进行研究。如有一株耐高温酵母一旦经EB诱变失去线粒体变为小菌落后，即失去耐高温特性。说明耐热性与线粒体有关系。因而应用原生质体技术对耐热性的转移和对耐热机理进行研究将是一条途径。蒋文泓等以禽多杀性巴氏杆菌5A弱毒菌株与禽大肠杆菌02弱毒菌株作亲本，进行原生质体融合后再生，成功地获得3株具有双亲本耐药性和双菌体血清型的融合菌株，试图获得具多种疾病免疫力的疫苗生产菌株。
结论
原生质体融合技术作为遗传育种的一个有效手段，已广泛应用于微生物育种工作的各个方面。但是还都只局限于两个菌之间的融合，没有扩展到3个以上的菌之间的融合，如果能开展多个菌之间的融合，则有可能获得同时具多个优良性状的菌株，进一步拓宽应用面。
参考文献
[1]裘娟萍，王普.虾青素高产菌种的选育[J].工业微生物，2001，31（2）：5-9.
[2]蒋文泓，黄青云.禽多杀性巴氏杆菌与大肠杆菌科间原生质体融合的研究[J].畜牧兽医学报，1999，30（3）：267-272.