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摘 要：研究流感病毒裂解疫苗生产用流感病毒毒种H1N1、H3N2、BY和BV四个型别的工作种子批传代稳定性对研制和生产四价流感病毒裂解疫苗是至关重要的。把四个型别的流感病毒毒株工作种子批分别通过在SPF鸡胚上连续传代7次，检测每代收获液的血凝效价和病毒滴度。结果表明：我们制备的四个流感工作种子批毒种能够在生产过程中保持传代稳定性。
关键词：流感毒种 传代 稳定性
随着流感病毒在鸡胚中传代次数的增加，引起抗原性漂移的可能性增加，确定生产用毒种能保持良好的传代稳定性是确保后续研制和生产顺利进行的基础。
【材料和方法】
一、实验材料
1. 实验试剂
H1N1、H3N2、BY和BV工作种子、9-11日龄SPF鸡胚、营养肉汤、 1%的鸡血球、生理盐水。
2. 实验仪器
超净工作台、孵化箱、漩涡混合仪、 微量移液器、一次性注射器、稀释瓶、5ml吸管、1ml吸管、96孔U型板等。
二、方法
1. 各传代流感病毒收获液的制备
取四个型别的流感病毒工作种子各一支，在超净工作台里，稀释成10-4接种于9-11日龄SPF鸡胚尿囊腔，每个型别接种5枚鸡胚，做好标记（剩余的流感病毒做血凝效价和病毒滴度检测，记为0代），放34℃，湿度为60%的孵化箱，培养72小时后取灯检合格的鸡胚，按照型别分别收集其病毒液，将各鸡胚收获的病毒液混合均匀后，按照相同程序在SPF鸡胚上进行传代，第一次收获后的病毒液为1代，进行7次传代，分别检测各代次收获液的血凝效价和病毒滴度，以确定毒种的稳定性。
2. 血凝效价测定
在血凝板的第一孔加入100ul生理盐水，从第二孔开始每孔各加入25ul生理盐水，从1：5开始稀释，于第一孔加入25ul病毒收获液，用微量移液器反复吹打使其充分混匀，吸出25ul加入到第二孔以相同方式混匀，一直到最后一孔，最后一孔去掉25ul，第一孔去掉75ul，阴性对照孔加入生理盐水25ul，于每孔加入25ul1%鸡血球，充分混匀后置于室温30-60分钟，结果判断：阴性对照应为阴性，以出现++（含一个血凝单位）为最终判断标准。
3. 病毒滴度测定
将流感病毒收获液用营养肉汤做10倍系列稀释，稀释度从10-1至10-9，取稀释度10-4至10-9，接种 9-11日龄鸡胚，每个稀释度接种4个鸡胚，每胚接种0.2ml，阴性对照接种营养肉汤，接种4个鸡胚，每胚接种0.2ml，接种后做好标记，放34℃，湿度为60%的孵化箱，培养72小时后取灯检合格的鸡胚，按照型别和稀释度在96孔U型板上做好标记，每胚取25ul病毒液，加入25ul1%鸡血球，充分混匀后置于室温30-60分钟。结果判断：阴性对照应为阴性，以出现（+）为最终判断标准。
【结果】
H1N1、H3N2、BY和BV四个型别的工作种子批毒种分别通过在SPF鸡胚上连续传代7次，检测相应型别收获液的血凝效价和病毒滴度都呈稳定状态。试验表明四个型别的流感病毒工作代毒种可以用于四价流感病毒裂解疫苗的研制和生产。
【讨论】
流行性感冒（简称流感）是由流感病毒引起的急性呼吸道传染病，主要通过感染含有病毒的飞沫以及气溶胶的形式传染给易感着，具有高度传染性。研究表明：流感病毒是一种很容易变异的病毒，当变异达到一定程度，从而导致一种新的流感病毒产生时，因人类不具备相应的抗体，而易引起大流行[1]。目前世界范围内使用的流感病毒疫苗都是每年由WHO提供的两个A型和一个B型三种流感病毒减毒株制备的，国内外很多研究都证明它是安全的，有效的[2][3][4][5][6]。为了使流感病毒疫苗涵盖范围更广，国内外都在进行四价流感病毒疫苗的研究，即增加一个B型毒种。要想能够稳定的大批量生产流感疫苗，首先要对毒种进行稳定性研究，确保疫苗生产的稳定性。流感原液生产时流感毒种工作种子只需传代1次后即可收集流感病毒液，为确保四价流感病毒疫苗的研究和生产的可靠性，我们将工作种子进行了7次传代，检测结果表明H1N1、H3N2、BY和BV工作种子经过7次传代仍然是稳定的。
參考文献
[1]白植生，朱既明.流行性感冒.见：耿贯一，主编：流行病学.第2版，北京：人民卫生出版社，1998，449-471
[2]唐伟，李峰光，王锋，等.国产与进口流感疫苗接种反应与免疫效果比较.中国生物制品学杂志，2003，16（1）：121-123
[3]M GONZALEZ，MC PIREZ，E WARD，et al.Safety and immunogenicity of a paediatricpresentation of an influenza vaccine.Arch Dis Child.2000，83（6）：488-91
[4]Glathe H，Bigl S，Grosche A.Comparison of humoral immune response to trivalentinfluenza split vaccine in young，middle-aged and eldly people.Vaccine 1993，11（7）：702-5.
[5]李美霞，黄源华，方玉蓉，等.流感疫苗的安全性和免疫效果研究.1999/2000年防感灵（VAXIGRIP）应用学术研讨会，中国三亚，出版单位：深圳巴斯德.梅里厄生物制品有限公司
[6]王树巧，涂秋凤，鲁芳，等.国产流行性感冒病毒裂解疫苗的安全性和免疫原性研究.中国计划免疫2002，8（5）：266-270
关键词：流感毒种 传代 稳定性
随着流感病毒在鸡胚中传代次数的增加，引起抗原性漂移的可能性增加，确定生产用毒种能保持良好的传代稳定性是确保后续研制和生产顺利进行的基础。
【材料和方法】
一、实验材料
1. 实验试剂
H1N1、H3N2、BY和BV工作种子、9-11日龄SPF鸡胚、营养肉汤、 1%的鸡血球、生理盐水。
2. 实验仪器
超净工作台、孵化箱、漩涡混合仪、 微量移液器、一次性注射器、稀释瓶、5ml吸管、1ml吸管、96孔U型板等。
二、方法
1. 各传代流感病毒收获液的制备
取四个型别的流感病毒工作种子各一支，在超净工作台里，稀释成10-4接种于9-11日龄SPF鸡胚尿囊腔，每个型别接种5枚鸡胚，做好标记（剩余的流感病毒做血凝效价和病毒滴度检测，记为0代），放34℃，湿度为60%的孵化箱，培养72小时后取灯检合格的鸡胚，按照型别分别收集其病毒液，将各鸡胚收获的病毒液混合均匀后，按照相同程序在SPF鸡胚上进行传代，第一次收获后的病毒液为1代，进行7次传代，分别检测各代次收获液的血凝效价和病毒滴度，以确定毒种的稳定性。
2. 血凝效价测定
在血凝板的第一孔加入100ul生理盐水，从第二孔开始每孔各加入25ul生理盐水，从1：5开始稀释，于第一孔加入25ul病毒收获液，用微量移液器反复吹打使其充分混匀，吸出25ul加入到第二孔以相同方式混匀，一直到最后一孔，最后一孔去掉25ul，第一孔去掉75ul，阴性对照孔加入生理盐水25ul，于每孔加入25ul1%鸡血球，充分混匀后置于室温30-60分钟，结果判断：阴性对照应为阴性，以出现++（含一个血凝单位）为最终判断标准。
3. 病毒滴度测定
将流感病毒收获液用营养肉汤做10倍系列稀释，稀释度从10-1至10-9，取稀释度10-4至10-9，接种 9-11日龄鸡胚，每个稀释度接种4个鸡胚，每胚接种0.2ml，阴性对照接种营养肉汤，接种4个鸡胚，每胚接种0.2ml，接种后做好标记，放34℃，湿度为60%的孵化箱，培养72小时后取灯检合格的鸡胚，按照型别和稀释度在96孔U型板上做好标记，每胚取25ul病毒液，加入25ul1%鸡血球，充分混匀后置于室温30-60分钟。结果判断：阴性对照应为阴性，以出现（+）为最终判断标准。
【结果】
H1N1、H3N2、BY和BV四个型别的工作种子批毒种分别通过在SPF鸡胚上连续传代7次，检测相应型别收获液的血凝效价和病毒滴度都呈稳定状态。试验表明四个型别的流感病毒工作代毒种可以用于四价流感病毒裂解疫苗的研制和生产。
【讨论】
流行性感冒（简称流感）是由流感病毒引起的急性呼吸道传染病，主要通过感染含有病毒的飞沫以及气溶胶的形式传染给易感着，具有高度传染性。研究表明：流感病毒是一种很容易变异的病毒，当变异达到一定程度，从而导致一种新的流感病毒产生时，因人类不具备相应的抗体，而易引起大流行[1]。目前世界范围内使用的流感病毒疫苗都是每年由WHO提供的两个A型和一个B型三种流感病毒减毒株制备的，国内外很多研究都证明它是安全的，有效的[2][3][4][5][6]。为了使流感病毒疫苗涵盖范围更广，国内外都在进行四价流感病毒疫苗的研究，即增加一个B型毒种。要想能够稳定的大批量生产流感疫苗，首先要对毒种进行稳定性研究，确保疫苗生产的稳定性。流感原液生产时流感毒种工作种子只需传代1次后即可收集流感病毒液，为确保四价流感病毒疫苗的研究和生产的可靠性，我们将工作种子进行了7次传代，检测结果表明H1N1、H3N2、BY和BV工作种子经过7次传代仍然是稳定的。
參考文献
[1]白植生，朱既明.流行性感冒.见：耿贯一，主编：流行病学.第2版，北京：人民卫生出版社，1998，449-471
[2]唐伟，李峰光，王锋，等.国产与进口流感疫苗接种反应与免疫效果比较.中国生物制品学杂志，2003，16（1）：121-123
[3]M GONZALEZ，MC PIREZ，E WARD，et al.Safety and immunogenicity of a paediatricpresentation of an influenza vaccine.Arch Dis Child.2000，83（6）：488-91
[4]Glathe H，Bigl S，Grosche A.Comparison of humoral immune response to trivalentinfluenza split vaccine in young，middle-aged and eldly people.Vaccine 1993，11（7）：702-5.
[5]李美霞，黄源华，方玉蓉，等.流感疫苗的安全性和免疫效果研究.1999/2000年防感灵（VAXIGRIP）应用学术研讨会，中国三亚，出版单位：深圳巴斯德.梅里厄生物制品有限公司
[6]王树巧，涂秋凤，鲁芳，等.国产流行性感冒病毒裂解疫苗的安全性和免疫原性研究.中国计划免疫2002，8（5）：266-270