【摘 要】
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目的 研究增强型绿色荧光蛋白(EGFP)标记的人血管内皮细胞生长因子165(hVEGF165)重组腺病毒载体的快速构建及在骨髓移植后小鼠体内的分布和表达效率.方法利用细菌内质粒间同源重组法快速构建EGFP标记的重组腺病毒Ad-EGFP/hVEGF165;通过体外试验观察病毒的形态、滴度和安全性;经尾静脉注射3×108PFU的重组腺病毒给同基因骨髓移植BALB/c小鼠,在不同时间检测重组腺病毒在小鼠
【机 构】
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430022,武汉,华中科技大学同济医学院附属协和医院血液病研究所血液科,430022,武汉,华中科技大学同济医学院附属协和医院血液病研究所血液科,430022,武汉,华中科技大学同济医学院附属协和医
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目的 研究增强型绿色荧光蛋白(EGFP)标记的人血管内皮细胞生长因子165(hVEGF165)重组腺病毒载体的快速构建及在骨髓移植后小鼠体内的分布和表达效率.方法利用细菌内质粒间同源重组法快速构建EGFP标记的重组腺病毒Ad-EGFP/hVEGF165;通过体外试验观察病毒的形态、滴度和安全性;经尾静脉注射3×108PFU的重组腺病毒给同基因骨髓移植BALB/c小鼠,在不同时间检测重组腺病毒在小鼠体内分布和hVEGF165的表达.结果通过细菌内质粒间同源重组法在短期内成功构建了复制缺陷型重组腺病毒载体Ad-EGFP/hVEGF165;纯化的病毒颗粒在电镜下成分均一,滴度可达1010～1011PFU/ml.Hela细胞感染病毒后经多次传代未见细胞病变.借助于荧光显微镜在不同时期观测到小鼠心、肺、肝、脾、肾、小肠组织EGFP;RT-PCR分析和免疫组化染色显示脏器内有显著VEGF表达.各脏器未见明显毒性反应.ELISA法检测小鼠血浆中VEGF水平升高可达(866.67±97.13)pg/ml.结论本研究结果证实细菌内同源重组法构建腺病毒载体具有高效、省时、省力的特点,并成功介导了hVEGF165基因在骨髓移植小鼠体内的安全、稳定表达,为今后在骨髓移植过程中开展基因治疗奠定了基础。
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