【摘 要】
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目的 研究BMSCs成骨分化过程中环指蛋白11 (ring finger protein 11,RNF11)对Akt信号通路的调节作用,为进一步阐明BMSCs成骨分化机制和用于临床治疗提供思路.方法 从健康人体新鲜骨髓中分离培养BMSCs并传代,取第4代细胞经流式细胞术,成骨、成软骨和成脂诱导培养鉴定后用于实验.BMSCs成骨诱导分化培养0～14d,通过茜素红染色和ALP染色检测其成骨分化程度,并用Western blot法检测RNF11蛋白表达.取第4代BMSCs,分为空白对照组(A组)、空载慢病毒(L
【机 构】
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中山大学孙逸仙纪念医院生物治疗技术中心 广州510120;中山大学中山医学院 广州510080;郑州大学基础医学院微生物学与免疫学系 郑州450001
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目的 研究BMSCs成骨分化过程中环指蛋白11 (ring finger protein 11,RNF11)对Akt信号通路的调节作用,为进一步阐明BMSCs成骨分化机制和用于临床治疗提供思路.方法 从健康人体新鲜骨髓中分离培养BMSCs并传代,取第4代细胞经流式细胞术,成骨、成软骨和成脂诱导培养鉴定后用于实验.BMSCs成骨诱导分化培养0～14d,通过茜素红染色和ALP染色检测其成骨分化程度,并用Western blot法检测RNF11蛋白表达.取第4代BMSCs,分为空白对照组(A组)、空载慢病毒(Lv-NC)组(B组)和敲低RNF 11 (Lv-ShRNF11)组(C组),成骨诱导分化培养0～14d,采用Western blot检测RNF 11蛋白表达,茜素红染色和ALP染色检测其成骨分化程度,14d实时荧光定量PCR (real-time fluorescence quantitative PCR,qRT-PCR)检测BMSCs成骨标志物Runx2、骨钙素(osteocalcin,OCN)及骨桥蛋白(osteopontin,OPN)的mRNA相对表达量;采用Western blot检测Akt、Smad1/5/8及β-catenin信号通路蛋白相对表达量,以磷酸化前后比值表示.为研究RNF11对Akt信号通路的影响机制,取第4代BMSCs分为Lv-NC转染组(A1组)、Lv-ShRNF 11转染组(B1组)和添加Akt信号通路激活剂SC79的Lv-ShRNF 11转染组(C1组),14d时采用Western blot检测RNF11和Akt信号通路蛋白相对表达量,茜素红染色、ALP染色及qRT-PCR检测成骨相关指标.结果 流式细胞术及成骨、成软骨和成脂诱导培养鉴定显示分离培养细胞为BMSCs.RNF 11蛋白相对表达量随成骨分化时间延长而逐渐增加(P＜0.05);下调RNF11后,茜素红和ALP染色示C组相较于A、B组BMSCs成骨分化程度降低,qRT-PCR检测示Runx2、OCN、OPN mRNA相对表达量减少(P＜0.05).随成骨分化时间延长,RNF 11与Akt信号通路蛋白相对表达量均上升(P＜0.05).下调RNF 11后,C组相较于A、B组,其Akt信号通路蛋白相对表达量显著降低(P＜0.05),而对Smad1/5/8以及β-catenin信号通路蛋白相对表达量无明显影响(P＞0.05).B1、C1组相较于A1组,其RNF11蛋白相对表达量减少(P＜0.05),B1组相较于A1、C1组,其Akt信号通路蛋白相对表达量降低(P＜0.05);茜素红与ALP染色示C1组BMSCs成骨分化程度稍低于A1组(P＞0.05),而明显高于B1组(P＜0.05);qRT-PCR检测示C1组Runx2、OCN、OPN mRNA相对表达量稍低于A1组(P＞0.05),而明显高于B1组(P＜0.05).结论 RNF11通过正向调控Akt信号通路激活水平促进BMSCs向成骨细胞分化.RNF 11可作为提高BMSCs修复骨缺损疗效以及治疗骨代谢病的潜在靶点.
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