猪带绦虫乳酸脱氢酶基因的序列分析、克隆表达和免疫学分析

来源 :中国畜牧兽医学会家畜寄生虫学分会第六次代表大会暨第十次学术研讨会 | 被引量 : 0次 | 上传用户:hanjiajiaji
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目的:利用生物信息学方法从猪带绦虫成虫cDNA文库中识别乳酸脱氢酶A的基因(lactate dehydrogenase A,LDH-A),分析和预测其编码蛋白的结构和功能,并对其进行克隆、表达和免疫学特性的初步研究。 方法:利用生物信息学网站如NCBI和ExPASy中有关基因和蛋白的序列和结构信息分析的各种工具,结合其它生物信息学分析软件包,从猪带绦虫成虫全长cDNA质粒文库中识别乳酸脱氢酶A(TsLDH-A)的基因及其编码区,分析、预测该基因编码的蛋白的结构与功能;并将Ts LDH-A克隆到原核表达质粒pET-28a(+)中,在大肠杆菌BL-21/DE3中用IPTG诱导表达,表达产物经SDS-PAGE鉴定及用镍离子金属螯合剂亲和层析柱进行纯化,纯化产物用蛋白印迹(western Blotting)进行免疫学分析。 结果:该基因全长1332 bp,编码331个氨基酸。其氨基酸序列与其它物种LDH-A氨基酸序列一致性可达54%,具有乳酸脱氢酶保守结构域。其编码的蛋白理论分子量和等电点分别为35461.1 Da和7.09;有3个跨膜区,无亚细胞定位序列;具有多个磷酸化位点,蛋白的理化性质较稳定。预测有四个主要的B细胞抗原表住,L-乳酸脱氢酶活化位点之一的His192包含于表住190-199 aa中。酶催化位点的三个关键氨基酸在不同物种中保守,在空间结构上位置相互靠近。PCR、双酶切及DNA测序结果均表明重组质粒pET-28a(+)-Ts LDH—A构建成功。SDS-PAGE结果表明目的基因在大肠杆菌BL-21/DE3中获得高效表达。经亲和层析获得了高纯度蛋白。重组蛋白能被Ts LDH-A重组蛋白免疫的SD大鼠血清、感染了猪带绦虫的病人血清及猪血清识别,表明其具有较好的免疫原性和免疫反应性。 结论:应用生物信息方法从猪带绦虫成虫cDNA文库中筛选出了Ts LDH—A的全长序列并预测得到其编码蛋白的结构与功能方面的信息,该基因可在原核表达系统中获得具有免疫学活性的高效表达,为进一步研究该蛋白的功能奠定了基础。
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