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DOI:10.3969/j.issn.1004-6755.2014.04.019
硝基呋喃类抗菌剂（Nitrofurans）是一种广效性抗生素，对大多数革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌、某些真菌和原虫均有作用，因其价格低廉且对动物性传染病的预防与治疗具有良好的效果而曾经在养殖业中较为广泛应用。但是，经研究证明，含有硝基呋喃类抗菌剂及其代谢物的食物被人类长期食用后，有致癌、致畸胎等健康危害，因此已被大多数国家明令禁止在人类可食用的动物源性食品中使用。
硝基呋喃类抗菌剂原型药在生物体内代谢迅速，无法检测；而其代谢物呋喃唑酮（Furazolidone）、呋喃咜酮（Furaltadone）、呋喃西林（Nitrofurazone）和呋喃妥因（Nitrofurantoin）能与组织蛋白质紧密结合而相当稳定，故利用其代谢物的检测可反映硝基呋喃类抗菌剂的残留状况。
目前，动物体内硝基呋喃类代谢物残留的检测方法主要有液相色谱法、液相色谱—质谱法和液相色谱—串联质谱法，上述方法虽然灵敏度高、准确性好，常作为药物残留检测的确认方法。然而此类方法对仪器和操作人员要求都较高；每个样品检测费用大；前处理过程均需过夜衍生，耗时较长，不能满足现场抽检的需求和推广应用。ELISA技术与上述仪器分析方法相比，具有以下优点：一是样本前处理过程相对简单，对仪器和人员要求不是很高，检测人员经过短期培训即可上岗；二是样品整个检测过程中所用试剂多数为无机试剂，与有机试剂相比，对人体伤害和环境污染威胁小，检测人员无需特殊防护用具；三是该方法耗时短，检测过程只需要不到1 h，适于现场检测和大量样本筛查；四是检出限低，灵敏度高，可达到μg/kg或ng/kg水平，符合药物残留检测分析的要求。
基于以上特点，ELISA法已成为目前药品残留检测的有效检测方法之一。
近几年来，本中心利用ELISA法承担上级渔业主管部门下达的水产品国家违禁药物残留的筛查任务，筛选出的阳性样品，分别经山东省水产品质量检测中心和中国水产科学研究院黄河水产研究所用大型仪器分析方法确证，准确率为100%。在圆满完成上级渔业主管部门下达的筛选任务的同时，本中心取得了一定的操作经验，现将经验小结，与大家共勉。
1 加标回收
样品在萃取、转移及净化处理等过程中，会有基体干扰或待检成分的损失情况。因此，加标回收率的测定是实验室内经常用以自控的一种质量控制技术，以验证检测结果的准确度。
1.1 样品空白的选取
样品空白是指在检测程序中，使用某个浓度的样品作为仪器的零基准。样品空白可以抵消加入测试试剂前由于样品自身含有待测成分引起的正误差。空白样品的选择对检测结果的准确性至关重要。
加标回收分空白加标回收和样品加标回收两种，几年来，本中心针对这两种加标回收做了大量的验证试验。结果发现，样品加标回收，如果待测样品背景值较高，所得回收率会出现不稳定现象。本中心利用同一样品对呋喃西林和呋喃咜酮两个项目同时做加标回收试验，试验结果得知，该样品中呋喃咜酮背景值很低，两个添加浓度的加标回收率均在80%～110%之间；而呋喃西林项目由于背景值较高，两个添加浓度的回收率分别为207和81.7，出现不稳定现象。试验结果如表1所示。
本中心还请教了省级水产品检测中心等权威检测机构经验丰富的专家，得出的结论与本中心所做验证试验结果一致。所以本中心一般选择空白加标回收，所得结果准确率为100%。
表1 同一样品不同项目的加标回收率试验结果
试验
项目 试样测定值
/μg•kg-1 加标浓度
/μg•kg-1 加标试样测定
值/μg•kg-1 加标回
收率/%
呋喃咜酮 0.082 0.5 0.548 93.2
1.0 0.974 89.2
呋喃西林 0.242 0.5 1.281 207
1.0 1.059 81.7
1.2 加标试验应遵循的几条原则
1.2.1 一致原则 样品与加标试样按相同的操作步骤和方法同时测定，保证试验条件一致。为保证准确度，样品和加标样分别进行平行测试，以平均值带入计算。
1.2.2 可比原则 加标样中原始样品的取样量、稀释倍数及测试体积，尽可能与测试样品一致。
一般文献上要求加标量不宜过大，一般为待测成分含量的0.5～2.0倍，且加标后的总含量不应超过方法的测定上限。要想做到这一点，需要检测人员正确估量样品中待测成分的含量，这对于经验不是很丰富的检测人员来说难度有点大。本中心一般选取标准曲线范围的中间浓度做加标浓度。
1.2.3 不变原则 加标物的浓度宜高，加标体积宜小，一般不超过原始试样体积的1%，保持样品的基体不变。
1.2.4 适用原则 容易实施，便于回收率的计算。
加标回收率=
（加标式样测定值-式样测定值）加标浓度×100%
2 加标回收率的意义
加标回收除了考察待测样品前处理及上机测试全过程中所测成分的破坏或损失情况，更重要的一点，对于国家食品安全有残留限量的药物残留，需要用加标回收率折算检测结果，以防止不合格样品流向市场，给广大消费者造成伤害。例如，某种兽药的限量值为1.0 μg/kg，如果某个样品的检测结果为0.9 μg/kg，在不做加标回收的情况下可以判定该产品合格。但是，如果做了加标回收，加标回收率为80%，通过检测结果和回收率折算，该产品的兽药浓度为1.1 μg/kg，该产品应被判定为不合格。
3 标准曲线的分析利用
目前市面上ELISA试剂盒的价格普遍较高，一般96孔的试剂盒的价格在四五千元左右。进行样品检测时，一般要求标准曲线的相关系数达到0.99以上才可以对样品中待测成分进行准确定量，但有时候难免出现标准曲线系数做的比较低的情况。为了节约试验经费，我们一般通过对相关系数比较低的曲线各个标准点进行分析。如果一条曲线相关系数的偏离只是因为极个别的标准点，其他的几个点的线性关系良好，那么，只要是位于这几个点浓度范围内的所检样品的检测值是可信的。
4 ELISA方法操作过程中注意事項
4.1 样品前处理
提取试剂的添加要准确，涡旋混匀的时间要严格按照说明书操作，时间过长，容易造成乳化现象和溶解出更多的杂质成分；时间过短，容易造成混合不均匀、提取不充分，造成假阴性。离心转速或离心力应达到说明书要求，样品氮吹时，应尽量吹干，不要残留有机溶剂。去除上层正己烷等脂肪层时，应确保去除干净，防止对结果造成干扰影响。
4.2 试剂盒保存
试剂盒应当在2～8 ℃的温度下储存（试剂盒说明书有特殊规定的，严格按照规定的储存条件执行），不能在过热或过冷的温度下放置时间太长。
微孔板应尽量真空、干燥保存以保持更好的稳定性，因此剩余的微孔板要尽快放回密封袋保存；标准物质和无色的显色剂对光敏感，因此要避免直接暴露在光线下。
4.3 试剂盒平衡
每个试剂盒都有相应的最佳反应温度，用前一般需在室温放置20～30 min以上。试剂及样本没有回复至室温20～25 ℃，将导致检测吸光度值和灵敏度发生变化。冬季室温低，可将试剂盒置37℃温箱20 min。如果试剂体积较大则需要回温时间较长，不能用温水浴回温。
4.4 保证标准品与样品的同步性
为了保证样品检测结果的准确可靠，应力求与标准品同步检测；
加入标准品、样品、酶结合物应用液、底物应用液以及各种试剂时，为确保时间的一致性，应使用定量多道加液器，且加液过程要迅速完成；
定量多道加液器应定期校准，并且用前检查吸嘴是否套紧，确保吸液量一致；
从低浓度到高浓度地添加标准品，降低影响标准曲线质量的风险；
一个人操作时，一个项目一次不宜多于两块板同时测定。
4.5 避免板内差异性大应注意的问题
加液器有两档，为了保证微量加样的准确性和均匀性，我们一般采取“吸二打一”的手法，即吸液时推到二档，出液时推到一档；
加液后若出现气泡会导致反应液界面有差异，在孵育前一定要将气泡用枪头扎破；
加液过程中若有液体溅出，不但对邻近孔造成污染，而且会流到板底，影响吸光度，从而影响检测结果的准确性；
加样应尽量垂直悬空加样，将所加液体按规定的量加入微孔板的1/3处，避免加在孔壁上部，以保证加样的准确性。
4.6 试剂盒操作的环境条件
确保在标准室温20～25 ℃下操作，避免在空调风口或者窗口进行操作，温度过低，会出现吸光度值偏低的现象；如果在阳光直射下试验，不但会因为过热造成试剂蒸发，而且会造成吸光度值偏高等导致试验结果失准的现象。如果操作台温度过低，应铺垫纸巾或者其他物料。
4.7 样品和试剂的混匀
稀释前、后的试剂及样品在加样前混合要均匀，否则会出现重复性不好的现象。
4.8 孵育
孵育是ELISA测定中影响测定成败的关键因素之一；
孵育的温度和时间应按规定力求准确，以免出现吸光度值偏高或偏低的现象，导致试验结果出现偏差；
孵育过程中，反应板不宜叠放，以保证各孔的温度都能迅速达到孵育要求；
如果样品量少，一次测定只用少量微孔板，这种情况下，建议将板孔放在板架中间位置较好，这样可以很容易地排除“边缘效应”，以提高测定的重复性。
4.9 洗板
在ELISA分析中的再現性，很大程度上取决于洗板的一致性；
洗板次数以及每次每孔洗液的加入量要规范，以免因洗涤不当而造成吸光度值过高的现象，并且吸液量不要溢出孔外，以免影响吸光度的准确性；
最后一次洗涤后进行下一步操作前，甩去板孔中洗液后，一定要在吸水纸上将板孔拍干，否则可能影响试验结果；
板孔干燥时间过长，会出现标准曲线相关系数低、重复性不好的现象。所以洗板拍干后应立即进行下一步操作。
4.10 显色
ELISA法测定中，若出现0浓度标准溶液的吸光度值低于1或高于2.5的情况时，即使标准曲线的相关系数达到要求亦不能采用。为了避免出现这种情况，在定量测定中，显色时间一般根据试剂盒说明书控制。也可依据经验，在显色较深时，适当提前2～3 min终止反应；在显色较浅时，适当延长2～3 min显色反应时间。
4.11 假阳性与假阴性的产生原因及处理方法
见表2。
表2 假阳性与假阴性的产生原因及处理方法
问题 原因 解决方法
假阳性
假阴性 水质原因
试验操作
原因
实验仪器
原因
衍生化试
剂原因
曲线原因
点复溶液验证 应确保纯水
现制现用
离心不彻底 延长离心时间或
改变转速
样本污染 更换样本
吸取到其他相层 准确吸取相层
乳化未完全处理 70℃水浴处理
未清洗干净 正确的洗涤器皿
有机试剂干扰 更换试剂
有机试剂变质 更换试剂
曲线不好 保证曲线正常
综上所述，尽管ELISA测定的操作步骤非常简单，但有可能会影响测定结果的因素却较多，分布在测定操作的各步骤之中，本文特对常见问题及原因归纳总结，供同行借鉴。
（收稿日期：2014-01-22）
硝基呋喃类抗菌剂（Nitrofurans）是一种广效性抗生素，对大多数革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌、某些真菌和原虫均有作用，因其价格低廉且对动物性传染病的预防与治疗具有良好的效果而曾经在养殖业中较为广泛应用。但是，经研究证明，含有硝基呋喃类抗菌剂及其代谢物的食物被人类长期食用后，有致癌、致畸胎等健康危害，因此已被大多数国家明令禁止在人类可食用的动物源性食品中使用。
硝基呋喃类抗菌剂原型药在生物体内代谢迅速，无法检测；而其代谢物呋喃唑酮（Furazolidone）、呋喃咜酮（Furaltadone）、呋喃西林（Nitrofurazone）和呋喃妥因（Nitrofurantoin）能与组织蛋白质紧密结合而相当稳定，故利用其代谢物的检测可反映硝基呋喃类抗菌剂的残留状况。
目前，动物体内硝基呋喃类代谢物残留的检测方法主要有液相色谱法、液相色谱—质谱法和液相色谱—串联质谱法，上述方法虽然灵敏度高、准确性好，常作为药物残留检测的确认方法。然而此类方法对仪器和操作人员要求都较高；每个样品检测费用大；前处理过程均需过夜衍生，耗时较长，不能满足现场抽检的需求和推广应用。ELISA技术与上述仪器分析方法相比，具有以下优点：一是样本前处理过程相对简单，对仪器和人员要求不是很高，检测人员经过短期培训即可上岗；二是样品整个检测过程中所用试剂多数为无机试剂，与有机试剂相比，对人体伤害和环境污染威胁小，检测人员无需特殊防护用具；三是该方法耗时短，检测过程只需要不到1 h，适于现场检测和大量样本筛查；四是检出限低，灵敏度高，可达到μg/kg或ng/kg水平，符合药物残留检测分析的要求。
基于以上特点，ELISA法已成为目前药品残留检测的有效检测方法之一。
近几年来，本中心利用ELISA法承担上级渔业主管部门下达的水产品国家违禁药物残留的筛查任务，筛选出的阳性样品，分别经山东省水产品质量检测中心和中国水产科学研究院黄河水产研究所用大型仪器分析方法确证，准确率为100%。在圆满完成上级渔业主管部门下达的筛选任务的同时，本中心取得了一定的操作经验，现将经验小结，与大家共勉。
1 加标回收
样品在萃取、转移及净化处理等过程中，会有基体干扰或待检成分的损失情况。因此，加标回收率的测定是实验室内经常用以自控的一种质量控制技术，以验证检测结果的准确度。
1.1 样品空白的选取
样品空白是指在检测程序中，使用某个浓度的样品作为仪器的零基准。样品空白可以抵消加入测试试剂前由于样品自身含有待测成分引起的正误差。空白样品的选择对检测结果的准确性至关重要。
加标回收分空白加标回收和样品加标回收两种，几年来，本中心针对这两种加标回收做了大量的验证试验。结果发现，样品加标回收，如果待测样品背景值较高，所得回收率会出现不稳定现象。本中心利用同一样品对呋喃西林和呋喃咜酮两个项目同时做加标回收试验，试验结果得知，该样品中呋喃咜酮背景值很低，两个添加浓度的加标回收率均在80%～110%之间；而呋喃西林项目由于背景值较高，两个添加浓度的回收率分别为207和81.7，出现不稳定现象。试验结果如表1所示。
本中心还请教了省级水产品检测中心等权威检测机构经验丰富的专家，得出的结论与本中心所做验证试验结果一致。所以本中心一般选择空白加标回收，所得结果准确率为100%。
表1 同一样品不同项目的加标回收率试验结果
试验
项目 试样测定值
/μg•kg-1 加标浓度
/μg•kg-1 加标试样测定
值/μg•kg-1 加标回
收率/%
呋喃咜酮 0.082 0.5 0.548 93.2
1.0 0.974 89.2
呋喃西林 0.242 0.5 1.281 207
1.0 1.059 81.7
1.2 加标试验应遵循的几条原则
1.2.1 一致原则 样品与加标试样按相同的操作步骤和方法同时测定，保证试验条件一致。为保证准确度，样品和加标样分别进行平行测试，以平均值带入计算。
1.2.2 可比原则 加标样中原始样品的取样量、稀释倍数及测试体积，尽可能与测试样品一致。
一般文献上要求加标量不宜过大，一般为待测成分含量的0.5～2.0倍，且加标后的总含量不应超过方法的测定上限。要想做到这一点，需要检测人员正确估量样品中待测成分的含量，这对于经验不是很丰富的检测人员来说难度有点大。本中心一般选取标准曲线范围的中间浓度做加标浓度。
1.2.3 不变原则 加标物的浓度宜高，加标体积宜小，一般不超过原始试样体积的1%，保持样品的基体不变。
1.2.4 适用原则 容易实施，便于回收率的计算。
加标回收率=
（加标式样测定值-式样测定值）加标浓度×100%
2 加标回收率的意义
加标回收除了考察待测样品前处理及上机测试全过程中所测成分的破坏或损失情况，更重要的一点，对于国家食品安全有残留限量的药物残留，需要用加标回收率折算检测结果，以防止不合格样品流向市场，给广大消费者造成伤害。例如，某种兽药的限量值为1.0 μg/kg，如果某个样品的检测结果为0.9 μg/kg，在不做加标回收的情况下可以判定该产品合格。但是，如果做了加标回收，加标回收率为80%，通过检测结果和回收率折算，该产品的兽药浓度为1.1 μg/kg，该产品应被判定为不合格。
3 标准曲线的分析利用
目前市面上ELISA试剂盒的价格普遍较高，一般96孔的试剂盒的价格在四五千元左右。进行样品检测时，一般要求标准曲线的相关系数达到0.99以上才可以对样品中待测成分进行准确定量，但有时候难免出现标准曲线系数做的比较低的情况。为了节约试验经费，我们一般通过对相关系数比较低的曲线各个标准点进行分析。如果一条曲线相关系数的偏离只是因为极个别的标准点，其他的几个点的线性关系良好，那么，只要是位于这几个点浓度范围内的所检样品的检测值是可信的。
4 ELISA方法操作过程中注意事項
4.1 样品前处理
提取试剂的添加要准确，涡旋混匀的时间要严格按照说明书操作，时间过长，容易造成乳化现象和溶解出更多的杂质成分；时间过短，容易造成混合不均匀、提取不充分，造成假阴性。离心转速或离心力应达到说明书要求，样品氮吹时，应尽量吹干，不要残留有机溶剂。去除上层正己烷等脂肪层时，应确保去除干净，防止对结果造成干扰影响。
4.2 试剂盒保存
试剂盒应当在2～8 ℃的温度下储存（试剂盒说明书有特殊规定的，严格按照规定的储存条件执行），不能在过热或过冷的温度下放置时间太长。
微孔板应尽量真空、干燥保存以保持更好的稳定性，因此剩余的微孔板要尽快放回密封袋保存；标准物质和无色的显色剂对光敏感，因此要避免直接暴露在光线下。
4.3 试剂盒平衡
每个试剂盒都有相应的最佳反应温度，用前一般需在室温放置20～30 min以上。试剂及样本没有回复至室温20～25 ℃，将导致检测吸光度值和灵敏度发生变化。冬季室温低，可将试剂盒置37℃温箱20 min。如果试剂体积较大则需要回温时间较长，不能用温水浴回温。
4.4 保证标准品与样品的同步性
为了保证样品检测结果的准确可靠，应力求与标准品同步检测；
加入标准品、样品、酶结合物应用液、底物应用液以及各种试剂时，为确保时间的一致性，应使用定量多道加液器，且加液过程要迅速完成；
定量多道加液器应定期校准，并且用前检查吸嘴是否套紧，确保吸液量一致；
从低浓度到高浓度地添加标准品，降低影响标准曲线质量的风险；
一个人操作时，一个项目一次不宜多于两块板同时测定。
4.5 避免板内差异性大应注意的问题
加液器有两档，为了保证微量加样的准确性和均匀性，我们一般采取“吸二打一”的手法，即吸液时推到二档，出液时推到一档；
加液后若出现气泡会导致反应液界面有差异，在孵育前一定要将气泡用枪头扎破；
加液过程中若有液体溅出，不但对邻近孔造成污染，而且会流到板底，影响吸光度，从而影响检测结果的准确性；
加样应尽量垂直悬空加样，将所加液体按规定的量加入微孔板的1/3处，避免加在孔壁上部，以保证加样的准确性。
4.6 试剂盒操作的环境条件
确保在标准室温20～25 ℃下操作，避免在空调风口或者窗口进行操作，温度过低，会出现吸光度值偏低的现象；如果在阳光直射下试验，不但会因为过热造成试剂蒸发，而且会造成吸光度值偏高等导致试验结果失准的现象。如果操作台温度过低，应铺垫纸巾或者其他物料。
4.7 样品和试剂的混匀
稀释前、后的试剂及样品在加样前混合要均匀，否则会出现重复性不好的现象。
4.8 孵育
孵育是ELISA测定中影响测定成败的关键因素之一；
孵育的温度和时间应按规定力求准确，以免出现吸光度值偏高或偏低的现象，导致试验结果出现偏差；
孵育过程中，反应板不宜叠放，以保证各孔的温度都能迅速达到孵育要求；
如果样品量少，一次测定只用少量微孔板，这种情况下，建议将板孔放在板架中间位置较好，这样可以很容易地排除“边缘效应”，以提高测定的重复性。
4.9 洗板
在ELISA分析中的再現性，很大程度上取决于洗板的一致性；
洗板次数以及每次每孔洗液的加入量要规范，以免因洗涤不当而造成吸光度值过高的现象，并且吸液量不要溢出孔外，以免影响吸光度的准确性；
最后一次洗涤后进行下一步操作前，甩去板孔中洗液后，一定要在吸水纸上将板孔拍干，否则可能影响试验结果；
板孔干燥时间过长，会出现标准曲线相关系数低、重复性不好的现象。所以洗板拍干后应立即进行下一步操作。
4.10 显色
ELISA法测定中，若出现0浓度标准溶液的吸光度值低于1或高于2.5的情况时，即使标准曲线的相关系数达到要求亦不能采用。为了避免出现这种情况，在定量测定中，显色时间一般根据试剂盒说明书控制。也可依据经验，在显色较深时，适当提前2～3 min终止反应；在显色较浅时，适当延长2～3 min显色反应时间。
4.11 假阳性与假阴性的产生原因及处理方法
见表2。
表2 假阳性与假阴性的产生原因及处理方法
问题 原因 解决方法
假阳性
假阴性 水质原因
试验操作
原因
实验仪器
原因
衍生化试
剂原因
曲线原因
点复溶液验证 应确保纯水
现制现用
离心不彻底 延长离心时间或
改变转速
样本污染 更换样本
吸取到其他相层 准确吸取相层
乳化未完全处理 70℃水浴处理
未清洗干净 正确的洗涤器皿
有机试剂干扰 更换试剂
有机试剂变质 更换试剂
曲线不好 保证曲线正常
综上所述，尽管ELISA测定的操作步骤非常简单，但有可能会影响测定结果的因素却较多，分布在测定操作的各步骤之中，本文特对常见问题及原因归纳总结，供同行借鉴。
（收稿日期：2014-01-22）