【摘 要】
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目的构建抗抗LPS Fab-BPI真核表达载体,并在CHO细胞中表达.方法通过RT-PCR,获得广谱抗LPS mAb C3A2(IgG)的Fd和完整轻链(LC)cDNA片段.在分别构建了pcDNA3-Fd和pcDNA3-LC表达
【机 构】
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第四军医大学西京医院临床分子生物学研究中心,第四军医大学微生物学教研室,
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目的构建抗抗LPS Fab-BPI真核表达载体,并在CHO细胞中表达.方法通过RT-PCR,获得广谱抗LPS mAb C3A2(IgG)的Fd和完整轻链(LC)cDNA片段.在分别构建了pcDNA3-Fd和pcDNA3-LC表达载体的基础上,将包括BPI N端抗LPS活性中心的180bp DNA片段,通过一段长16个氨基酸的linker连接于上述Fab表达载体中Fd基因的下游,构建成Fab-BPI融合蛋白(FB)真核表达载体.将pcDNA3-LC质粒中包括hCMV启动子、LC和BGH polyA等序列在内的片段,插入到pcDNA3-Fd中hCMV启动子上游,从而构建成单质粒的Fab-BPI表达载体pcD-NA3-FB,转染真核细胞.结果序列测定表明,重组质粒构建正确.pcDNA3-FB转染CHO细胞后,经ELISA、免疫荧光和mRNA鉴定表达成功,免疫印迹试验显示,与抗κ轻链和抗BPI抗体反应的蛋白区带的M,均为60 000左右.交叉反应试验证明,Fab和FB与多种革兰氏阴性菌的LPS有交叉反应性.结论成功地在CHO细胞中表达出了抗LPS Fab-BPI(FB)融合蛋白.FB作为融合蛋白,集广泛交叉反应性和强大中和活性于一身,有可能成为更适于临床应用的新的抗LPS免疫制剂.
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