【摘 要】
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目的探讨缺氧诱导因子1α(HIF-1α)对大鼠血管内皮细胞通透性的调控作用及相关机制。方法取12只雄性SD大鼠，35～38 d龄，分离主动脉培养血管内皮细胞，4 d后观察细胞形态，并取第2或3代细胞进行以下实验。(1)取大鼠血管内皮细胞，采用随机数字表法(分组方法下同)分为空白对照组、阴性对照组、HIF-1α干扰序列1组、HIF-1α干扰序列2组和HIF-1α干扰序列3组，每组3孔。阴性对照组和H
【机 构】
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安徽医科大学第一附属医院烧伤科，合肥 230022,安徽医科大学第一附属医院烧伤科，合肥 230022,安徽省肥西县上派镇中心卫生院烧伤科 231200,安徽医科大学第一附属医院烧伤科，合肥 2300
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目的探讨缺氧诱导因子1α(HIF-1α)对大鼠血管内皮细胞通透性的调控作用及相关机制。
方法取12只雄性SD大鼠，35～38 d龄，分离主动脉培养血管内皮细胞，4 d后观察细胞形态，并取第2或3代细胞进行以下实验。(1)取大鼠血管内皮细胞，采用随机数字表法(分组方法下同)分为空白对照组、阴性对照组、HIF-1α干扰序列1组、HIF-1α干扰序列2组和HIF-1α干扰序列3组，每组3孔。阴性对照组和HIF-1α干扰序列1组、HIF-1α干扰序列2组和HIF-1α干扰序列3组细胞经脂质体2000分别转染GV248空质粒和含HIF-1α干扰序列1、干扰序列2、干扰序列3的GV248重组质粒，空白对照组细胞仅加入脂质体2000。转染24 h后，采用实时荧光定量反转录PCR法和蛋白质印迹法(检测方法下同)分别检测各组细胞HIF-1α的mRNA和蛋白的表达，选取干扰效率最高的序列。(2)另取大鼠血管内皮细胞，分为空白对照组、阴性对照组和HIF-1α低表达组，每组3孔。空白对照组细胞仅加入脂质体2000，阴性对照组和HIF-1α低表达组细胞经脂质体2000分别转染GV248空质粒及实验(1)中筛选的低表达HIF-1α重组质粒。培养14 d，检测各组细胞HIF-1α的mRNA和蛋白表达水平。(3)另取大鼠血管内皮细胞，分为空白对照组、阴性对照组、HIF-1α高表达组，每组3孔。空白对照组细胞仅加入脂质体2000，阴性对照组、HIF-1α高表达组细胞经脂质体2000分别转染GV230空质粒和HIF-1α高表达重组质粒。培养14 d，检测各组细胞HIF-1α的mRNA和蛋白表达水平。(4)取实验(1)中3组、实验(2)中3组细胞，检测肌球蛋白轻链激酶(MLCK)、磷酸化肌球蛋白轻链(p-MLC)和带状闭合蛋白1(ZO-1)的mRNA和蛋白表达水平。对数据行单因素方差分析、t检验。
结果培养4 d，细胞呈梭形，成功培养出大鼠血管内皮细胞。(1)HIF-1α干扰序列1组、HIF-1α干扰序列2组和HIF-1α干扰序列3组细胞HIF-1α的干扰效率分别为47.66%、45.79%、62.62%，干扰序列3组细胞干扰效率最高。转染24 h后，HIF-1α干扰序列3组细胞HIF-1α的mRNA和蛋白表达水平明显低于空白对照组(t＝18.404、9.140，P<0.01)及阴性对照组(t＝15.099、7.096，P<0.01)。(2)培养14 d后，HIF-1α低表达组细胞HIF-1α的mRNA和蛋白表达水平明显低于空白对照组(t＝21.140、5.440，P<0.01)和阴性对照组(t＝14.310、5.210，P<0.01)。(3)培养14 d后，HIF-1α高表达组细胞HIF-1α的mRNA和蛋白表达水平明显高于空白对照组(t＝19.160，7.710，P<0.01)及阴性对照组(t＝19.890、7.500，P<0.01)。(4)转染24 h后，HIF-1α低表达组细胞MLCK、p-MLC的mRNA表达水平显著低于空白对照组(t＝2.709、4.011，P<0.05或P<0.01)和阴性对照组(t＝2.373、3.744，P<0.05或P<0.01)，HIF-1α低表达组细胞ZO-1的mRNA表达水平显著高于空白对照组和阴性对照组(t＝4.285、5.050，P<0.01)。HIF-1α高表达组细胞MLCK、p-MLC的mRNA表达水平显著高于空白对照组(t＝9.118、11.313，P<0.01)和阴性对照组(t＝9.073、11.280，P<0.01)，HIF-1α高表达组细胞ZO-1的mRNA表达水平显著低于空白对照组和阴性对照组(t＝2.889、2.640，P<0.05)。(5)转染24 h后，HIF-1α低表达组细胞MLCK、p-MLC的蛋白表达水平显著低于空白对照组(t＝2.652、3.983，P<0.05或P<0.01)和阴性对照组(t＝2.792、4.065，P<0.05或P<0.01)，HIF-1α低表达组细胞ZO-1的蛋白表达显著高于空白对照组和阴性对照组(t＝3.881、3.570，P<0.01)。HIF-1α高表达组细胞MLCK、p-MLC的蛋白表达水平为1.18±0.24、0.68±0.22，显著高于空白对照组的0.41±0.21、0.35±0.14(t＝5.011、3.982，P<0.05或P<0.01)和阴性对照组的0.43±0.20、0.36±0.12(t＝4.880、3.862，P<0.05或P<0.01)。HIF-1α高表达组细胞ZO-1的蛋白表达水平为0.08±0.06，显著低于空白对照组的0.20±0.09和阴性对照组的0.19±0.09(t＝4.178、3.830，P<0.05或P<0.01)。
结论HIF-1α通过上调MLCK、p-MLC，下调ZO-1的表达，从而增加大鼠血管内皮细胞通透性。
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