【摘 要】
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以猪A组轮状病毒mRNA为模板,应用优化的反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)技术,扩增了2 331bp的Vp4全长基因,通过T-A克隆技术,将PCR产物克隆至克隆载体pGEM-T中,构建质粒pGEM-T-V
【机 构】
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吉林农业大学动物科学技术学院,吉林农业大学菌物研究所
【基金项目】
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国家863计划(No.2003AA241121002);吉林省科技厅项目(No．20020220);国家自然科学基金(No．30200199);吉林省杰出青年基金(No.20030118);中国博士后科学基金项目(No．2002031156);吉林农业大学青年教师启动基金(No.2002-QQN-002)
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以猪A组轮状病毒mRNA为模板,应用优化的反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)技术,扩增了2 331bp的Vp4全长基因,通过T-A克隆技术,将PCR产物克隆至克隆载体pGEM-T中,构建质粒pGEM-T-Vp4。以SalⅠ和KpnⅠ双酶切pGEM-T-Vp4和以胸苷酸合成酶基因(thymidylate synthase,thyA)为选择压力的非抗生素抗性的穿梭表达载体pW425t,并将纯化的Vp4基因亚克隆至表达载体pW425t中,构建出可以在乳酸菌与大肠杆菌之间穿梭表达的原核表达重组质粒pW425t-Vp4。将pW425t-Vp4转化至thyA基因缺陷型的大肠杆菌感受态E．coli X13中,通过生长功能弥补筛选阳性克隆,SDS-PAGE分析,可见约87．67 Ku融合蛋白。Western blot分析表明,该蛋白具有与轮状病毒多克隆抗体的反应原性,研究结果为pW425t-Vp4在乳酸菌受体菌株中表达提供科学依据。
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