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摘要：从甘蔗叶中分离出内生真菌并对其多样性进行分析。结果发现，从不同季节和不同叶片部位的甘蔗叶中共分离到172株内生真菌，通过菌落形态学特征和ITS序列鉴定这些内生真菌分属为8属10种；从夏季的叶片中分离到6属8种，冬季的叶片中分离到7属9种；从老叶中分离到全部的8属10种，幼叶中分离到5属6种。主要优势种为曲霉属（Aspergillus sp）和炭疽菌属（Colletotrichum sp），两者占总菌株分离数的85%以上。
关键词：甘蔗叶；内生真菌；多样性；分离；鉴定
中图分类号： S182文献标志码：
文章编号：1002-1302（2017）16-0093-03
收稿日期：2016-04-07
基金项目：广西壮族自治区研究生教育创新计划（编号：P3130098105）。
作者简介：周宁（1990—），男，河南新蔡人，硕士研究生，主要从事微生物制药的研究。E-mail：zhaoxiaoluw@126com。
通信作者：谢庆武，硕士，副研究员，硕士生导师，主要从事生物技术的研究。E-mail：xqw@gxueducn。
植物内生真菌（endophytic fungi）是指其生活史中的部分或全部阶段定植于健康植物组织内，不造成宿主植物明显伤害的真菌，包括表生的腐生菌、潜伏性的病原菌和菌根菌。研究表明，植物内生真菌具有多种应用价值，其部分代謝产物具有抗肿瘤、抗菌[3]、抗氧化[4]等多种药用活性；植物内生真菌与其宿主植物同样也有较为紧密的关系，能够调节宿主植物的生长发育[5]、增强宿主植物的抗逆性，影响宿主植物根部的土壤环境及微生物群落和生物防治植物病虫害等[8]。甘蔗是重要的制糖经济作物，我国南方等地均有广泛种植，甘蔗叶作为甘蔗植株进行光合作用的主要部位，其内生真菌的多样性分布可能对甘蔗植株的糖产量及品质有较高影响，但国内对甘蔗叶内生真菌的种类及分布情况鲜有研究。本研究主要对甘蔗叶内生真菌进行分离及鉴定，以期了解甘蔗叶内生真菌的多样性，为合理开发利用甘蔗叶内生真菌资源提供依据。
1材料与方法
11试验材料
试验所用新鲜甘蔗叶采自广西大学农学院试验田。植物DNA提取试剂盒（天根生化科技有限公司）。次氯酸钠、乙醇、葡萄糖等均为国产分析纯。
主要培养基为：PDA培养基（马铃薯200 g，琼脂15 g，葡萄糖20 g，蒸馏水1 L，pH值自然）和PDB培养基（马铃薯 200 g，葡萄糖20 g，蒸馏水1 L，pH值自然）。
12试验方法
121内生真菌的分离与纯化
采用组织分离法分离甘蔗叶内生真菌[9]。具体操作步骤为：取新鲜健康的甘蔗叶片用蒸馏水清洗干净，切成长条状，置于超净工作台内。首先使用活性氯含量为22%的次氯酸钠溶液浸泡消毒5 min，无菌水冲洗3次；然后用体积分数为75%的乙醇浸泡消毒1 min，无菌水冲洗3次；用无菌剪刀将消毒后的叶片剪碎至长为2～4 mm 的小块，分别置于PDA平板上，每板等距放置7块，28 ℃ 下培养3～5 d。待叶片周围长出足量菌丝体后，依据真菌的形态特征并采用平板划线法进行菌株的纯化。纯化后的菌种保存至4 ℃冰箱备用。
122内生真菌的鉴定
菌落形态特征：取纯化后的菌种接种至PDA培养基上培养，定期观察、记录各菌株生长过程中的菌落形态特征，并依据《真菌鉴定手册》进行初步鉴定。
分子生物学鉴定：取纯化后的菌种经PDB发酵后采用DNA提取试剂盒进行总DNA的提取，使用真菌通用引物ITS1（5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′）和ITS4（5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′）扩增其58S rDNA-ITS序列。扩增产物回收纯化后由深圳华大基因测序。
123数据处理与分析
测序后得到的ITS序列在NCBI数据库中进行相似性检索，并通过软件MEGA60进行聚类分析，采用邻接法（Neighbor-Joining），设置重复次数为1 000次、bootstrap值≥50%构建系统发育树。
2结果与分析
21甘蔗叶内生真菌的分离与鉴定
211内生真菌的形态学特征
从甘蔗叶中共分离到172株内生真菌，依据真菌的菌落形态特征初步判断有10种不同的菌株（表1、图1），具体种属须要依据分子生物学准确鉴定。
212内生真菌的系统发育树
根据形态学特征初步判断的10种不同的甘蔗叶内生真菌进行ITS序列的扩增，均获得大小为500 bp左右的目的条带（图2），获得的ITS序列测序后进行BLAST比对分析并构建系统发育树（图3）。依据序列的相似性原理进行菌种鉴定，其中相似性≥99%时可鉴定至种，相似性≥95%时可鉴定至属。结果表明，172株甘蔗叶内生真菌分别属于8属10种，其中优势菌群主要为曲霉属（Aspergillus sp）、炭疽菌属（Colletotrichum sp），分别占分离数的541%、314%。
22甘蔗叶内生真菌的分布
221不同叶片部位内生真菌的分布
从老叶中共分离到8属10种内生真菌，分别为玉蜀黍赤霉菌（Gibberella zeae）、塔地囊孢壳菌（Glomerella tucumanensis）、意大利果皮叶点霉（Phyllosticta capitalensis）、喙突脐蠕孢（Exserohilum rostratum）、胶孢炭疽菌（C gloeosporioides）、小球腔菌属（Leptosphaeria sp）、博宁炭疽菌（C boninense）、炭角菌属（Xylaria sp）、黑曲霉（A niger）、棘孢曲霉（A aculeatus）；从幼叶中共分离到5属6种内生真菌，分别为塔地囊孢壳菌、意大利果皮叶点霉、喙突脐蠕孢、胶孢炭疽菌、博宁炭疽菌、棘孢曲霉。表明不同叶片部位的内生真菌的分布有着较为明显的差异，老叶比幼叶具有更丰富的内生真菌种类分布。 222不同季节内生真菌的分布
从夏季的叶片中共分离到6属8种内生真菌，分别为玉蜀黍赤霉菌、塔地囊孢壳菌、意大利果皮叶点霉、胶孢炭疽菌、小球腔菌属、博宁炭疽菌、黑曲霉、棘孢曲霉；从冬季的叶片中共分离到7属9种内生真菌，分别为塔地囊孢壳菌、意大利果皮叶点霉、喙突脐蠕孢、胶孢炭疽菌、小球腔菌属、博宁炭疽菌、炭角菌属、黑曲霉、棘孢曲霉。其中，玉蜀黍赤霉菌仅在夏季的叶片中发现，喙突脐蠕孢和炭角菌属仅在冬季的叶片中出现，表明不同季节甘蔗叶内生真菌有着不同的种群分布。
3结论与讨论
甘蔗叶中共分离到172株内生真菌，通过菌落形态学
特征和ITS序列分析鉴定这些内生真菌分属8属10种，其中玉蜀黍赤霉菌、塔地囊孢壳菌、意大利果皮叶点霉、喙突脐蠕孢、胶孢炭疽菌、博宁炭疽菌为常见的植物病原菌，常常引起各种植物的病害。玉蜀黍赤霉菌是玉米穗腐病的主要病原菌之一[10]，塔地囊孢壳菌是引起甘蔗赤腐病的病原菌[11]，意大利果皮叶点霉普遍存在于各种柑橘中常引起柑橘的黑斑病[12]，喙突脐蠕孢经常感染香蕉叶造成香蕉的叶斑病，胶孢炭疽菌和博宁炭疽菌可以感染多种植物造成植物的炭疽病[14-17]。甘蔗叶内生真菌的主要优势种为曲霉属和炭疽菌属，两者占总分离数的85%以上，不同季节和不同叶片部位内生真菌的多样性分布也有较高的不同。和文献[18]比对后发现除炭角菌属以外其他内生真菌均为首次在甘蔗叶中发现，表明不同地域条件对甘蔗叶内生真菌的多样性分布具有很高的影响。本试验结果表明，甘蔗叶内生真菌具有丰富的多样性，对研究部分植物的致病菌传播方式及甘蔗叶内生真菌的开发利用具有一定的价值。
参考文献：
王磊，章卫民，潘清灵，等 白木香内生真菌的分离及分子鉴定[J] 菌物研究，2009，7（1）：37-42
Roopa G，Madhusudhan M C，Sunil K R，et al Identification of taxol-producing endophytic fungi isolated from Salacia oblonga through genomic mining approach[J] Journal of Genetic Engineering and Biotechnology，2015，13（2）：119-127
[3]Singh D，Rathod V，Ninganagouda S，et al Biosynthesis of silver nanoparticle by endophytic fungi Pencillium sp isolated from Curcuma longa（turmeric）and its antibacterial activity against pathogenic gram negative bacteria[J] Journal of Pharmacy Research，2013，7（5）：448-453
[4]Yadav M，Yadav A，Yadav J P In vitro antioxidant activity and total phenolic content of endophytic fungi isolated from Eugenia jambolana Lam[J] Asian Pacific Journal of Tropical Medicine，2014，7（1）：S256-S261
[5]任安芝，高玉葆 植物内生真菌一类应用前景广阔的资源微生物[J] 微生物学通报，2001，28（6）：90-93
[6]梁宇，高玉葆 内生真菌对植物生长发育及抗逆性的影响[J] 植物学通报，2000，17（1）：52
[7]周勇，郑璐雨，朱敏杰，等 内生真菌感染对禾草宿主生境土壤特性和微生物群落的影响[J] 植物生态学报，2014，38（1）：54-61
[8]Xiang L B，Gong S J，Yang L J，et al Biocontrol potential of endophytic fungi in medicinal plants from Wuhan Botanical Garden in China[J] Biological Control，2016（94）：47-55
[9]唐坤，李標，郭顺星 河南产丹参内生真菌的多样性分析[J] 中国药学杂志，2015，50（7）：570-573[HJ165mm]
[10]卢维宏，黄思良，陶爱丽，等 来自南阳玉米穗腐病样品的玉蜀黍赤霉菌的分离及其特性鉴定[J] 南阳师范学院学报，2010，9（12）：45-49
[11]吴夏明，沈万宽，罗明珠，等 甘蔗赤腐病及其病原菌研究进展[J] 中国糖料，2015，37（6）：66-70
[12]王兴红，陈国庆，王卫芳，等 柑橘黑斑病（Citrus Black Spot）发生危害现状和研究进展[J] 果树学报，2011，28（4）：674-679
[13]林善海，黄思良，岑贞陆，等 环境因素对香蕉叶斑病菌喙突脐蠕孢生长和产孢的影响[J] 菌物学报，2013，32（2）：226-238
[14]张贺，许春青，贾静，等 芒果胶孢炭疽菌和尖孢炭疽菌的室内毒力测定[J] 江苏农业科学，2015，43（8）：128-130
[15]王凡，胡奎，江慧，等 9种杀菌剂对核桃炭疽病菌的抑制作用及联合毒力[J] 江苏农业科学，2015，43（6）：127-129
[16]黄金凤，陈丙义，李金凤，等 草莓上胶孢炭疽菌的分离与鉴定[J] 西南农业学报，2012，25（5）：1714-1719
[17]汤铱泠，周国英，李河，等 多基因序列鉴定油茶炭疽病原Colletotrichum boninense新种[J] 热带作物学报，2015，36（5）：972-977
[18]Stuart R M，Romo A S，Pizzirani-Kleiner A A，et al Culturable [JP3]endophytic filamentous fungi from leaves of transgenic imidazolinone-tolerant sugarcane and its non-transgenic isolines[J] Archives of Microbiology，2010，192（4）：307-313
关键词：甘蔗叶；内生真菌；多样性；分离；鉴定
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主要培养基为：PDA培养基（马铃薯200 g，琼脂15 g，葡萄糖20 g，蒸馏水1 L，pH值自然）和PDB培养基（马铃薯 200 g，葡萄糖20 g，蒸馏水1 L，pH值自然）。
12试验方法
121内生真菌的分离与纯化
采用组织分离法分离甘蔗叶内生真菌[9]。具体操作步骤为：取新鲜健康的甘蔗叶片用蒸馏水清洗干净，切成长条状，置于超净工作台内。首先使用活性氯含量为22%的次氯酸钠溶液浸泡消毒5 min，无菌水冲洗3次；然后用体积分数为75%的乙醇浸泡消毒1 min，无菌水冲洗3次；用无菌剪刀将消毒后的叶片剪碎至长为2～4 mm 的小块，分别置于PDA平板上，每板等距放置7块，28 ℃ 下培养3～5 d。待叶片周围长出足量菌丝体后，依据真菌的形态特征并采用平板划线法进行菌株的纯化。纯化后的菌种保存至4 ℃冰箱备用。
122内生真菌的鉴定
菌落形态特征：取纯化后的菌种接种至PDA培养基上培养，定期观察、记录各菌株生长过程中的菌落形态特征，并依据《真菌鉴定手册》进行初步鉴定。
分子生物学鉴定：取纯化后的菌种经PDB发酵后采用DNA提取试剂盒进行总DNA的提取，使用真菌通用引物ITS1（5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′）和ITS4（5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′）扩增其58S rDNA-ITS序列。扩增产物回收纯化后由深圳华大基因测序。
123数据处理与分析
测序后得到的ITS序列在NCBI数据库中进行相似性检索，并通过软件MEGA60进行聚类分析，采用邻接法（Neighbor-Joining），设置重复次数为1 000次、bootstrap值≥50%构建系统发育树。
2结果与分析
21甘蔗叶内生真菌的分离与鉴定
211内生真菌的形态学特征
从甘蔗叶中共分离到172株内生真菌，依据真菌的菌落形态特征初步判断有10种不同的菌株（表1、图1），具体种属须要依据分子生物学准确鉴定。
212内生真菌的系统发育树
根据形态学特征初步判断的10种不同的甘蔗叶内生真菌进行ITS序列的扩增，均获得大小为500 bp左右的目的条带（图2），获得的ITS序列测序后进行BLAST比对分析并构建系统发育树（图3）。依据序列的相似性原理进行菌种鉴定，其中相似性≥99%时可鉴定至种，相似性≥95%时可鉴定至属。结果表明，172株甘蔗叶内生真菌分别属于8属10种，其中优势菌群主要为曲霉属（Aspergillus sp）、炭疽菌属（Colletotrichum sp），分别占分离数的541%、314%。
22甘蔗叶内生真菌的分布
221不同叶片部位内生真菌的分布
从老叶中共分离到8属10种内生真菌，分别为玉蜀黍赤霉菌（Gibberella zeae）、塔地囊孢壳菌（Glomerella tucumanensis）、意大利果皮叶点霉（Phyllosticta capitalensis）、喙突脐蠕孢（Exserohilum rostratum）、胶孢炭疽菌（C gloeosporioides）、小球腔菌属（Leptosphaeria sp）、博宁炭疽菌（C boninense）、炭角菌属（Xylaria sp）、黑曲霉（A niger）、棘孢曲霉（A aculeatus）；从幼叶中共分离到5属6种内生真菌，分别为塔地囊孢壳菌、意大利果皮叶点霉、喙突脐蠕孢、胶孢炭疽菌、博宁炭疽菌、棘孢曲霉。表明不同叶片部位的内生真菌的分布有着较为明显的差异，老叶比幼叶具有更丰富的内生真菌种类分布。 222不同季节内生真菌的分布
从夏季的叶片中共分离到6属8种内生真菌，分别为玉蜀黍赤霉菌、塔地囊孢壳菌、意大利果皮叶点霉、胶孢炭疽菌、小球腔菌属、博宁炭疽菌、黑曲霉、棘孢曲霉；从冬季的叶片中共分离到7属9种内生真菌，分别为塔地囊孢壳菌、意大利果皮叶点霉、喙突脐蠕孢、胶孢炭疽菌、小球腔菌属、博宁炭疽菌、炭角菌属、黑曲霉、棘孢曲霉。其中，玉蜀黍赤霉菌仅在夏季的叶片中发现，喙突脐蠕孢和炭角菌属仅在冬季的叶片中出现，表明不同季节甘蔗叶内生真菌有着不同的种群分布。
3结论与讨论
甘蔗叶中共分离到172株内生真菌，通过菌落形态学
特征和ITS序列分析鉴定这些内生真菌分属8属10种，其中玉蜀黍赤霉菌、塔地囊孢壳菌、意大利果皮叶点霉、喙突脐蠕孢、胶孢炭疽菌、博宁炭疽菌为常见的植物病原菌，常常引起各种植物的病害。玉蜀黍赤霉菌是玉米穗腐病的主要病原菌之一[10]，塔地囊孢壳菌是引起甘蔗赤腐病的病原菌[11]，意大利果皮叶点霉普遍存在于各种柑橘中常引起柑橘的黑斑病[12]，喙突脐蠕孢经常感染香蕉叶造成香蕉的叶斑病，胶孢炭疽菌和博宁炭疽菌可以感染多种植物造成植物的炭疽病[14-17]。甘蔗叶内生真菌的主要优势种为曲霉属和炭疽菌属，两者占总分离数的85%以上，不同季节和不同叶片部位内生真菌的多样性分布也有较高的不同。和文献[18]比对后发现除炭角菌属以外其他内生真菌均为首次在甘蔗叶中发现，表明不同地域条件对甘蔗叶内生真菌的多样性分布具有很高的影响。本试验结果表明，甘蔗叶内生真菌具有丰富的多样性，对研究部分植物的致病菌传播方式及甘蔗叶内生真菌的开发利用具有一定的价值。
参考文献：
王磊，章卫民，潘清灵，等 白木香内生真菌的分离及分子鉴定[J] 菌物研究，2009，7（1）：37-42
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