根椐GenBank中已发表的牛病毒性腹泻病毒(bovine viral diarrhea virus,BVDV)、牛冠状病毒(bovine coronavirus,BCV)和牛轮状病毒(bovine rotavirus,BRV)3种病毒基因序列,设计引物。在建立各病毒单项RT-PCR技术的基础上,优化三重RT-PCR反应条件,建立了3种病毒的三重RT-PCR技术,用这3对引物对同一样品中的BVDV、BCV、BRV核酸模板进行三重RT-PCR扩增,结果可同时扩增BVDV的466 bp,BCV的685 bp,BRV的247 bp的特异性片段,而对猪瘟病毒、牛传染性鼻气管炎病毒、牛呼吸道合胞体病毒和牛副流感病毒3型扩增结果均为阴性。敏感性测定表明,该三重RT-PCR技术能检出10 pg的BVDV、1 pg的BRV和10 pg的BCV模板。用45份临床病料对本研究多重RT-PCR技术和单项RT-PCR技术进行对比验证,显示两者的总符合率为100%。表明建立的多重RT-PCR检测方法具有特异、快速、准确的特点,可用于对这3种病毒的同时检测和鉴别诊断。