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摘要：目前用于病原微生物鉴定的高通量检测技术主要有多重PCR技术、实时荧光定量PCR技术、变性高效液相色谱分析技术、焦磷酸测序技术等，本文就这些高通量检测技术在病原微生物检测中的应用情况做一简短综述。
关键词：病原微生物；PCR技术；微生物检测
一、前言
目前，应用比较广泛的病原微生物检测方法主要有培养法、免疫学方法、PCR技术等，这些方法可以准确、灵敏地鉴定病原微生物，但是每次只能鉴定一种或少量几个样品。2003年SARS引起了全球性恐慌，随后禽流感爆发，接着出现猪链球菌和牛炭疽感染人类事件，以及甲型H1Nl流感病毒引起的全球流感的爆发流行，上述事件的出现对病原微生物的检测和诊断提出了更高的要求。鉴于可引起传染病的病原体种类繁多，并且不断发生变异，如何在最短时问内对病原体进行诊断成为目前研究的重点。高通量检测技术是近年发展起来的前沿技术，具有所需样品和试剂较少，自动化操作程度较高，快速省时、无污染、诊断结果精确等特点，很适合病原微生物的诊断与检测。目前用于病原微生物鉴定的高通量检测技术主要有：多重PCR技术、实时荧光定量PCR技术、变性高效液相色谱分析技术、焦磷酸测序技术和芯片技术等，本文就这些高通量检测技术在病原微生物检测中的应用情况做一综述。
二、多重PCR技术的应用
刘家云等初步建立了灵敏、特异的一步法检测志贺菌、沙门菌和霍乱弧菌的多重PCR体系，可用于高危腹泻致病菌的早期快速诊断。多重PCR还常用于病原微生物分子类型鉴定和抗药性研究，Kirschberg等应用多重PCR成功鉴定了乙肝病毒的6种基因型，此种方法与聚合酶链反应——限制片段长度多态型分析法相比，更简捷、准确率更高，且便于大量标本的检测。但多重PCR技术也存在较明显的不足：如扩增效率不高，敏感性偏低；扩增条件需要摸索与协调；可能出现引物问干扰等问题。
三、实时荧光定量PCR技术的应用
实时定量PCR技术中应用荧光染料和探针来保证扩增的特异性。并且荧光信号的强弱同扩增产物的量成正比，从而实现了真正意义上的定量。
由于荧光定量PCR能够精确定量核酸样品，因此，被广泛应用于分子生物学的各个方面，如：单个细胞或活细胞中的RNA的定量，信号传导研究及细胞因子的研究，筛选病毒和细菌病原体的检测等。而且在肿瘤的定量研究中，它们也应用很广，可用于检测肿瘤细胞、进行癌基因定量、最小残留疾病研究以及检测疗效，在细菌病原体检测方面，Haugkand 等应用实时定量PCR对曲霉菌、青霉菌和拟青霉菌进行了种和亚种之间核苷酸序列差异的比较鉴定，并据此确定了它们之间的亲缘关系。在病毒的检测筛选方面，Mumford等采用定量PCR技术成功地对大麦黄斑嵌花病毒进行了检测。
目前，用此方法还进行了对人类免疫缺陷病毒、结核杆菌、巨细胞病毒、EB病毒、流感病毒A、流感病毒B等病原体的检测。在基因表达研究方面，广西医科大学赖永榕等应用实时荧光定量PCR方法对β地中海贫血症（β地贫）患者β与γ珠蛋白mRNA水平进行检测，其结果特异性强、定量准确，为了解此病的分子病理机制及其临床诊断提供了可靠的检测数据。
四、变性高效液相色谱的应用
变性高效液相色谱具有完全自动化、快速、灵敏度高等特点，可以大量节省工作量，目前已在微生物诊断中得到了广泛的应用。Hurtle等运用DHPLC检测鼠疫耶氏菌的环丙沙星耐药基因，经过DNA测序后验证了DHPLC的准确性，还检测出了第5种新的基因型。William 等通过不同谱系对39种细菌进行DHPLC检测，成功地把DHPLC技术应用于细菌菌种的鉴定。
五、焦磷酸测序技术的特点及应用
焦磷酸测序技术的特点：
（1）可以快速、准确、实时地进行短DNA序列分析；
（2）检测通量较高，可以同时进行多达96份样品的测序；
（3）无需进行电泳，也无需荧光标记DNA片段，操作简单方便；
（4）可程序化，便于构建标准化的操作流程和规范，很好地保证临床结果的稳定性和准确性。目前该技术已广泛应用于微生物鉴定和分型、耐药性检测、法医学鉴定、遗传学分析、SNP分析、甲基化分析及药物基因组学等方面的研究。尤其在病原微生物检测方面的应用，充分显示出了该技术的优势。
六、总结
病原微生物的高通量检测技术是近年发展起来的前沿技术，在病原微生物的檢测和预防控制领域具有十分重要的应用价值，由于所需样品和剂量较少，且快速省时、无污染、诊断结果精确、自动化操作程度较高，很适合病原微生物的诊断与检测。多重PCR技术、实时荧光定量PCR技术、变性高效液相色谱分析技术、焦磷酸测序技术等各有优缺点，但是这些技术已在病毒、细菌诊断和检测及传染病临控等方面进行了大量研究，我们有理由相信，随着研究的不断进展和深入，这些高通量诊断技术和方法必将在传染病病原体诊断分析方面起到越来越重要的作用。
（作者单位：兰考县公共检验检测中心）
参考文献
[1]Chanrberian J S， Gihbs R A， Ranier J E et a1. Detection screening of the ducheme muscular dystrophy locus via multiplex DNA amplification [J].Nucl Acids Res，1988（16）：1141-1156.
[2]刘家云，龙铟，苏明权等.志贸菌、沙门菌和霍乱弧菌多重PCR快速检测体系的建立[J].解放军医学杂志，2007，32（11）：1190-l191.
[3]Kirsclaberg O， Schuttlm C， Repp R et al. A multiplex-PCR to identify Hepatitis B virus-genotypes A-F [J].J Clin Virol， 2004，29（1）：39-43.
[4]Klein D. Quantification using real-time PCR technology：applications and limitations [J].Trends in Moleeular Medieine，2002，2（8）：257-260.
关键词：病原微生物；PCR技术；微生物检测
一、前言
目前，应用比较广泛的病原微生物检测方法主要有培养法、免疫学方法、PCR技术等，这些方法可以准确、灵敏地鉴定病原微生物，但是每次只能鉴定一种或少量几个样品。2003年SARS引起了全球性恐慌，随后禽流感爆发，接着出现猪链球菌和牛炭疽感染人类事件，以及甲型H1Nl流感病毒引起的全球流感的爆发流行，上述事件的出现对病原微生物的检测和诊断提出了更高的要求。鉴于可引起传染病的病原体种类繁多，并且不断发生变异，如何在最短时问内对病原体进行诊断成为目前研究的重点。高通量检测技术是近年发展起来的前沿技术，具有所需样品和试剂较少，自动化操作程度较高，快速省时、无污染、诊断结果精确等特点，很适合病原微生物的诊断与检测。目前用于病原微生物鉴定的高通量检测技术主要有：多重PCR技术、实时荧光定量PCR技术、变性高效液相色谱分析技术、焦磷酸测序技术和芯片技术等，本文就这些高通量检测技术在病原微生物检测中的应用情况做一综述。
二、多重PCR技术的应用
刘家云等初步建立了灵敏、特异的一步法检测志贺菌、沙门菌和霍乱弧菌的多重PCR体系，可用于高危腹泻致病菌的早期快速诊断。多重PCR还常用于病原微生物分子类型鉴定和抗药性研究，Kirschberg等应用多重PCR成功鉴定了乙肝病毒的6种基因型，此种方法与聚合酶链反应——限制片段长度多态型分析法相比，更简捷、准确率更高，且便于大量标本的检测。但多重PCR技术也存在较明显的不足：如扩增效率不高，敏感性偏低；扩增条件需要摸索与协调；可能出现引物问干扰等问题。
三、实时荧光定量PCR技术的应用
实时定量PCR技术中应用荧光染料和探针来保证扩增的特异性。并且荧光信号的强弱同扩增产物的量成正比，从而实现了真正意义上的定量。
由于荧光定量PCR能够精确定量核酸样品，因此，被广泛应用于分子生物学的各个方面，如：单个细胞或活细胞中的RNA的定量，信号传导研究及细胞因子的研究，筛选病毒和细菌病原体的检测等。而且在肿瘤的定量研究中，它们也应用很广，可用于检测肿瘤细胞、进行癌基因定量、最小残留疾病研究以及检测疗效，在细菌病原体检测方面，Haugkand 等应用实时定量PCR对曲霉菌、青霉菌和拟青霉菌进行了种和亚种之间核苷酸序列差异的比较鉴定，并据此确定了它们之间的亲缘关系。在病毒的检测筛选方面，Mumford等采用定量PCR技术成功地对大麦黄斑嵌花病毒进行了检测。
目前，用此方法还进行了对人类免疫缺陷病毒、结核杆菌、巨细胞病毒、EB病毒、流感病毒A、流感病毒B等病原体的检测。在基因表达研究方面，广西医科大学赖永榕等应用实时荧光定量PCR方法对β地中海贫血症（β地贫）患者β与γ珠蛋白mRNA水平进行检测，其结果特异性强、定量准确，为了解此病的分子病理机制及其临床诊断提供了可靠的检测数据。
四、变性高效液相色谱的应用
变性高效液相色谱具有完全自动化、快速、灵敏度高等特点，可以大量节省工作量，目前已在微生物诊断中得到了广泛的应用。Hurtle等运用DHPLC检测鼠疫耶氏菌的环丙沙星耐药基因，经过DNA测序后验证了DHPLC的准确性，还检测出了第5种新的基因型。William 等通过不同谱系对39种细菌进行DHPLC检测，成功地把DHPLC技术应用于细菌菌种的鉴定。
五、焦磷酸测序技术的特点及应用
焦磷酸测序技术的特点：
（1）可以快速、准确、实时地进行短DNA序列分析；
（2）检测通量较高，可以同时进行多达96份样品的测序；
（3）无需进行电泳，也无需荧光标记DNA片段，操作简单方便；
（4）可程序化，便于构建标准化的操作流程和规范，很好地保证临床结果的稳定性和准确性。目前该技术已广泛应用于微生物鉴定和分型、耐药性检测、法医学鉴定、遗传学分析、SNP分析、甲基化分析及药物基因组学等方面的研究。尤其在病原微生物检测方面的应用，充分显示出了该技术的优势。
六、总结
病原微生物的高通量检测技术是近年发展起来的前沿技术，在病原微生物的檢测和预防控制领域具有十分重要的应用价值，由于所需样品和剂量较少，且快速省时、无污染、诊断结果精确、自动化操作程度较高，很适合病原微生物的诊断与检测。多重PCR技术、实时荧光定量PCR技术、变性高效液相色谱分析技术、焦磷酸测序技术等各有优缺点，但是这些技术已在病毒、细菌诊断和检测及传染病临控等方面进行了大量研究，我们有理由相信，随着研究的不断进展和深入，这些高通量诊断技术和方法必将在传染病病原体诊断分析方面起到越来越重要的作用。
（作者单位：兰考县公共检验检测中心）
参考文献
[1]Chanrberian J S， Gihbs R A， Ranier J E et a1. Detection screening of the ducheme muscular dystrophy locus via multiplex DNA amplification [J].Nucl Acids Res，1988（16）：1141-1156.
[2]刘家云，龙铟，苏明权等.志贸菌、沙门菌和霍乱弧菌多重PCR快速检测体系的建立[J].解放军医学杂志，2007，32（11）：1190-l191.
[3]Kirsclaberg O， Schuttlm C， Repp R et al. A multiplex-PCR to identify Hepatitis B virus-genotypes A-F [J].J Clin Virol， 2004，29（1）：39-43.
[4]Klein D. Quantification using real-time PCR technology：applications and limitations [J].Trends in Moleeular Medieine，2002，2（8）：257-260.