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【摘要】 目的 研究Mdm2、P53蛋白在乳腺肿瘤组织中的表达及临床意义。方法 应用免疫组化SP法检测Mdm2、P53蛋白在不同组织学类型乳腺癌60例、正常乳腺组织20例中的表达。结果 Mdm2、P53蛋白在乳腺癌组织中阳性表达率与正常乳腺组织比较差异有统计学意义(P<0.01)。Mdm2、P53蛋白表达与肿瘤大小比较无差异(P>0.05),在临床分期、腋窝淋巴结转移之间比较差异有统计学意义(P<0.01)。结论 Mdm2、P53蛋白在乳腺癌组织中的异常表达,说明在乳腺癌的发生及发展中起重要作用。
【关键词】 乳腺肿瘤;Mdm2蛋白;P53蛋白;免疫组织化学
Expression of P53 and MDM2protein in breast tumor
WANG Bin,GAO Jian-jun,GAO Ling,et al.Department of surgery,Weifang Women and Infants Nursing Center of Shandong.Weifang 261011,China
【Abstract】 Objective To investigate the expression of anti-oncogene P53 and cancergeneMDM2 proteins and their significance inthe pathogenesis and progress of Breast tumor.Methods To detect the expression ofP53 andMDM2 in 60 cases of Breast tumor and 20 cases of normal Breast tissue with immunoh is to chemical method.Results The positive rate of P53 in the tissues of the 60 cases of breast tumor is much higher than it in the 20 cases of normal breast tissues.There is statistical significance in the disparity(P<0.01).Mdm2,P53 protein expression and tumor size was no difference(P>0.05),clinical stage,axillary lymph node metastasis was significant difference(P<0.01).Conclusion Both P53 andMDM2 participate in the pathogenesis and progress of breast tumor and they can be considered as the biological index to evaluate breast tumor.
【Key words】 P53; MDM2; Breast tumorimmunohistochemistry
乳腺癌是妇女常见的恶性肿瘤之一,研究发现它已成为危害妇女健康的头号杀手,且其发病率近年来呈上升趋势。P53是研究最多的抑癌基因,野生型P53基因(wtP53)具有维持基因组稳定、抑制或阻止细胞转化,从而抑制肿瘤发生的功能[1]。Mdm2是一种进化保守基因,通过调节P53的功能而对细胞周期的控制是其重要作用。P53和Mdm2在调节肿瘤细胞的生长、分化、凋亡、浸润、转移和肿瘤血管生成等各方面均具有重要作用[2]。本实验采用免疫组织化学方法检测了P53、Mdm2在乳腺癌患者标本及正常乳腺组织中的表达,探讨P53、Mdm2在乳腺癌发生、发展中的意义及其对乳腺癌患者预后的影响。
1 材料和方法
1.1 材料 选取我院自2003年3月至2009年10月60例乳腺癌标本,术前均未接受化学治疗、放射治疗和内分泌治疗。所有组织标本经福尔马林固定,常规石蜡包埋。其中乳腺癌60例,均为女性。年龄28~71岁。组织类型:浸润性导管癌40例,浸润性小叶癌12例,单纯癌5例,髓样癌3例;乳腺癌临床分期根据国际抗癌协会制定的乳腺癌TNM分期标准,临床I期13例,Ⅱ期29例,III期12例,IV期6例;伴淋巴结转移者34例,无淋巴结转移者26例;选择性别、年龄构成与上述病例无显著差别的正常乳腺组织(取自I期和II期乳腺癌标本距肿瘤≥5 cm的癌旁正常乳腺组织)20例。每例制做成4 μm厚的切片以备免疫组化应用。每块组织的连续切片中,均取一张留做HE染色对照。
1.2 试剂及方法 采用P53、Mdm2鼠抗人单克隆抗体(工作浓度1:100),免疫组化S-P染色即用型试剂盒,购自武汉博士德公司。采用免疫组织化学S-P法,严格按照操作规定程序进行。对照实验同步进行。DAB显色,苏木素复色。用已知阳性切片作阳性对照,用PBS代替一抗作阴性对照。
1.3 结果判断 肿瘤细胞核染成棕黄色或棕褐色,胞浆染成浅黄色或棕褐色为阳性反应,高倍镜下取4个不同视野,各计数200个细胞,计算阳性细胞所占百分比,阳性细胞数计分:阳性数<5%为0;≥5%~<35%为1;≥35%~<70%为2;>70%为3。着色强度计分:不着色为0,弱着色(呈淡棕黄色)为1,强着色(呈明显的棕黄色)为2。阳性分级:以上两项相加,0~1分为(-),2分为(±),3分为(+),4分为(++),5分为(+++):-~±记为阴性,+~+++记为阳性。
1.4 统计学处理 采用SPSS15.0统计软件包对实验数据进行分析处理,采用χ2检验或连续性校正χ2检验。P<0.05认为差别有统计学意义。
2 结果
2.1 乳腺癌、正常乳腺组织中P53、Mdm2的表达 P53、Mdm2蛋白阳性表达细胞核均呈棕黄色。乳腺癌组织中P53、Mdm2阳性率分别为41.66%、53.33%。P53在正常乳腺组织中阳性率为10%,Mdm2在正常乳腺组织中阳性率为0。在乳腺癌与正常乳腺组织中阳性表达率比较差异有统计学意义(P<0.01)。见表1。
2.2 乳腺癌组织中PI3K表达与临床病理参数之间的关系 P53、Mdm2蛋白的表达与乳腺肿瘤大小不相关(P>0.05)。P53、Mdm2蛋白的表达在肿瘤分期位于Ⅰ-Ⅱ期和Ⅲ-Ⅳ期两者之间的表达率,差异有统计学意义(P<0.01)。P53、Mdm2蛋白的表达在有淋巴结转移和无淋巴结转移的表达率,差异有统计学意义(P<0.01),见表2。
2.3 乳腺癌组织中P53与Mdm2间的关系 两者之间经配对χ2检验,χ2=2.9,P=0.09,一致性Kappa=0.44,即两种基因表达差异无统计学意义,但有一致性,见表3。
3 讨论
肿瘤的形成是细胞内多个基因的事件,包括原癌基因和抑癌基因两大类。人类P53基因定位于17号染色体(17p13,17),有11个外显子和10个内含子,编码393个氨基酸残基的P53蛋白,P53蛋白分为野生型及突变型两种,野生型蛋白在所有正常细胞中呈低水平表达,但突变型蛋白在肿瘤细胞中常常高表达。大量的研究表明野生型P53蛋白(wtP53)主要参与DNA的修复和复制过程,DNA损伤后,P53基因活化,从而使P53依赖的细胞周期素依赖激酶(CDK)抑制剂p21waf1和DNA修复基因GADD45的转录上调,使细胞在G1期出现生长停滞,进行DNA修复。在P53基因缺失或突变的细胞,DNA损伤后不能通过P53介导的途径进入G1期停滞和DNA修复,遗传信息受损的细胞进入增殖,最终导致恶性肿瘤的发生[1,3-6],但由于其半衰期短,不易被检测出,然而突变型P53基因半衰期长,因此可以认为,免疫组化法阳性即提示为突变型P53基因的存在[7]。P53正常功能的丧失,最主要的方式是基因突变,迄今已发现10000种人类肿瘤的2500种基因突变,P53蛋白393个氨基酸有280个以上发现了突变[8]。另外,一些蛋白质与P53蛋白作用,也可导致其正常生物学功能的丧失。Storey等[9]已经证实人子宫颈癌、直肠癌的发生发展与HPVE6引起的P53蛋白功能的丧失有密切关系。
Mdm2基因最初是自发肿瘤鼠Balb/c3T3成纤维细胞系中鉴定出来的,人的Mdm2基因位于12号染色体长臂12q[10],其转录产物mRNA广泛表达于正常人体的多个器官,骨骼肌含量最高,其次为肝、肺、胰等,与细胞基本生理活动有关[11]。Mdm2最重要的作用是抑制wtP53基因的激活转录功能和抗肿瘤活性。其主要通过与P53形成复合物或加速P53的分解,而高水平的Mdm2基因产物本身也可以使P53的功能失活,抑制P53的功能,对P53起负调节的作用[12]。已有研究结果表明,Mdm2与一些肿瘤的发生发展密切相关[13]。Mdm2基因编码的P90蛋白能够与P53基因结合,使P53基因失去正常功能,导致肿瘤的发生。Mdm2基因突变或表达异常将导致平衡的破坏,可能与细胞转化和肿瘤的发生有关,Mdm2除抑制抑癌基因P53产生,其本身也有致癌作用。Mdm2在细胞转化过程中起癌基因作用的证据很多[14]。
本文结果显示,乳腺癌组织中Mdm2的表达要明显高于正常对照组,Mdm2的表达随Robson临床分期增高而增加,有淋巴结转移者Mdm2表达要高于无淋巴结转移者,Mdm2过度表达与乳腺癌的直径大小无相关性,与临床分期相关,提示Mdm2可促进肿瘤细胞向恶性化方向分化,并促进肿瘤的进展。有淋巴结转移患者乳腺癌组织癌细胞中,P53染色阳性率明显增高,说明乳腺癌细胞P53的过度沉积可诱导或促进肿瘤的浸润和转移。在本组中,Mdm2与P53两者有一致性(χ2=2.9,P=0.09),提示二者在乳腺癌发生、发展中起协同作用,共同参与乳腺癌进程。当然,二者亦可能有各自独立的作用过程,通过不同机制促进乳腺癌的发展,目前仍需进一步研究。
参考文献
[1] 史爱学,杨举轮.P53基因治疗恶性肿瘤的现状与趋势.西南国防医药,2004,14(1):101-103.
[2] Brady M,V latkovie N,Boyd MT,et al.Regulation of P53 and MDM2 activity by MTBP.Mol Cell Biol,2005,25(2):545-553.
[3] ShinizuM,Saitoh Y,Itoh H.Imm unoh istochem ical staining of Haras oncogene product in normal,begin,and m alignant human pancreatic tissues.Human Pathol,1990,21(6):607-612.
[4] 金焰,傅松滨.肿瘤抑制基因P53与肿瘤关系以及基因治疗的研究进展.国外遗传学分册,2001,24(4):201-206.
[5] 王朝霞,束永前.重组腺病毒P53基因治疗肺癌的研究进展.中国肺癌杂志,2005,8(2):148-151.
[6] 张爱菊,齐云飞.P53基因与人类肿瘤基因治疗研究进展.医学综述,2002,8(11):630-632.
[7] PorterA,GownAN,Kramp sg,et alWidespread P53 overexpression in human m alignant tumor.AM J Pathol,1992,140(1):145-148.
[8] Ichimiya S,Nimura Y,et al Mutation,allelotypin and transcription analyses of the P53 gene in prostatic carcinoma.Cancer Bes 1998,58(10):2076.
[9] Storey A,ThomasM,KalitaA,et al Role of a P53 polymorphisn in the developm ent of human an papilkm avirus-associated carcinoma.Nature,1998,393(6682):229.
[10] Oliner JD,Kinzler KW,Meltzer PS,et al Amplification of a gene encoding a P53 associated protein in human an sarcom as.Nature,1992,358(6381):80-83.
[11] 赵劲风.肝癌组织中P53基因及其下游基因的研究进展.中国现代医学杂志,2003,13(24):70-73.
[12] HU H,XIA SH,LIAD.A ssociation of P53 with proliferative potential in normal and neoplastic human an keratinocytes.Invest Dematol,1999,113:1099-1105.
[13] Weissm an AM.Them es and variations on ubiquitylation.Nat Rev MolCellBio,2001,2(3):169-178.
[14] Turb in DA,Cheang MC,Baidik CD.MDM2protein expression is a negative prognostic marker in breast carcinoma.Mod Patho,2006,19(1):69-74.
【关键词】 乳腺肿瘤;Mdm2蛋白;P53蛋白;免疫组织化学
Expression of P53 and MDM2protein in breast tumor
WANG Bin,GAO Jian-jun,GAO Ling,et al.Department of surgery,Weifang Women and Infants Nursing Center of Shandong.Weifang 261011,China
【Abstract】 Objective To investigate the expression of anti-oncogene P53 and cancergeneMDM2 proteins and their significance inthe pathogenesis and progress of Breast tumor.Methods To detect the expression ofP53 andMDM2 in 60 cases of Breast tumor and 20 cases of normal Breast tissue with immunoh is to chemical method.Results The positive rate of P53 in the tissues of the 60 cases of breast tumor is much higher than it in the 20 cases of normal breast tissues.There is statistical significance in the disparity(P<0.01).Mdm2,P53 protein expression and tumor size was no difference(P>0.05),clinical stage,axillary lymph node metastasis was significant difference(P<0.01).Conclusion Both P53 andMDM2 participate in the pathogenesis and progress of breast tumor and they can be considered as the biological index to evaluate breast tumor.
【Key words】 P53; MDM2; Breast tumorimmunohistochemistry
乳腺癌是妇女常见的恶性肿瘤之一,研究发现它已成为危害妇女健康的头号杀手,且其发病率近年来呈上升趋势。P53是研究最多的抑癌基因,野生型P53基因(wtP53)具有维持基因组稳定、抑制或阻止细胞转化,从而抑制肿瘤发生的功能[1]。Mdm2是一种进化保守基因,通过调节P53的功能而对细胞周期的控制是其重要作用。P53和Mdm2在调节肿瘤细胞的生长、分化、凋亡、浸润、转移和肿瘤血管生成等各方面均具有重要作用[2]。本实验采用免疫组织化学方法检测了P53、Mdm2在乳腺癌患者标本及正常乳腺组织中的表达,探讨P53、Mdm2在乳腺癌发生、发展中的意义及其对乳腺癌患者预后的影响。
1 材料和方法
1.1 材料 选取我院自2003年3月至2009年10月60例乳腺癌标本,术前均未接受化学治疗、放射治疗和内分泌治疗。所有组织标本经福尔马林固定,常规石蜡包埋。其中乳腺癌60例,均为女性。年龄28~71岁。组织类型:浸润性导管癌40例,浸润性小叶癌12例,单纯癌5例,髓样癌3例;乳腺癌临床分期根据国际抗癌协会制定的乳腺癌TNM分期标准,临床I期13例,Ⅱ期29例,III期12例,IV期6例;伴淋巴结转移者34例,无淋巴结转移者26例;选择性别、年龄构成与上述病例无显著差别的正常乳腺组织(取自I期和II期乳腺癌标本距肿瘤≥5 cm的癌旁正常乳腺组织)20例。每例制做成4 μm厚的切片以备免疫组化应用。每块组织的连续切片中,均取一张留做HE染色对照。
1.2 试剂及方法 采用P53、Mdm2鼠抗人单克隆抗体(工作浓度1:100),免疫组化S-P染色即用型试剂盒,购自武汉博士德公司。采用免疫组织化学S-P法,严格按照操作规定程序进行。对照实验同步进行。DAB显色,苏木素复色。用已知阳性切片作阳性对照,用PBS代替一抗作阴性对照。
1.3 结果判断 肿瘤细胞核染成棕黄色或棕褐色,胞浆染成浅黄色或棕褐色为阳性反应,高倍镜下取4个不同视野,各计数200个细胞,计算阳性细胞所占百分比,阳性细胞数计分:阳性数<5%为0;≥5%~<35%为1;≥35%~<70%为2;>70%为3。着色强度计分:不着色为0,弱着色(呈淡棕黄色)为1,强着色(呈明显的棕黄色)为2。阳性分级:以上两项相加,0~1分为(-),2分为(±),3分为(+),4分为(++),5分为(+++):-~±记为阴性,+~+++记为阳性。
1.4 统计学处理 采用SPSS15.0统计软件包对实验数据进行分析处理,采用χ2检验或连续性校正χ2检验。P<0.05认为差别有统计学意义。
2 结果
2.1 乳腺癌、正常乳腺组织中P53、Mdm2的表达 P53、Mdm2蛋白阳性表达细胞核均呈棕黄色。乳腺癌组织中P53、Mdm2阳性率分别为41.66%、53.33%。P53在正常乳腺组织中阳性率为10%,Mdm2在正常乳腺组织中阳性率为0。在乳腺癌与正常乳腺组织中阳性表达率比较差异有统计学意义(P<0.01)。见表1。
2.2 乳腺癌组织中PI3K表达与临床病理参数之间的关系 P53、Mdm2蛋白的表达与乳腺肿瘤大小不相关(P>0.05)。P53、Mdm2蛋白的表达在肿瘤分期位于Ⅰ-Ⅱ期和Ⅲ-Ⅳ期两者之间的表达率,差异有统计学意义(P<0.01)。P53、Mdm2蛋白的表达在有淋巴结转移和无淋巴结转移的表达率,差异有统计学意义(P<0.01),见表2。
2.3 乳腺癌组织中P53与Mdm2间的关系 两者之间经配对χ2检验,χ2=2.9,P=0.09,一致性Kappa=0.44,即两种基因表达差异无统计学意义,但有一致性,见表3。
3 讨论
肿瘤的形成是细胞内多个基因的事件,包括原癌基因和抑癌基因两大类。人类P53基因定位于17号染色体(17p13,17),有11个外显子和10个内含子,编码393个氨基酸残基的P53蛋白,P53蛋白分为野生型及突变型两种,野生型蛋白在所有正常细胞中呈低水平表达,但突变型蛋白在肿瘤细胞中常常高表达。大量的研究表明野生型P53蛋白(wtP53)主要参与DNA的修复和复制过程,DNA损伤后,P53基因活化,从而使P53依赖的细胞周期素依赖激酶(CDK)抑制剂p21waf1和DNA修复基因GADD45的转录上调,使细胞在G1期出现生长停滞,进行DNA修复。在P53基因缺失或突变的细胞,DNA损伤后不能通过P53介导的途径进入G1期停滞和DNA修复,遗传信息受损的细胞进入增殖,最终导致恶性肿瘤的发生[1,3-6],但由于其半衰期短,不易被检测出,然而突变型P53基因半衰期长,因此可以认为,免疫组化法阳性即提示为突变型P53基因的存在[7]。P53正常功能的丧失,最主要的方式是基因突变,迄今已发现10000种人类肿瘤的2500种基因突变,P53蛋白393个氨基酸有280个以上发现了突变[8]。另外,一些蛋白质与P53蛋白作用,也可导致其正常生物学功能的丧失。Storey等[9]已经证实人子宫颈癌、直肠癌的发生发展与HPVE6引起的P53蛋白功能的丧失有密切关系。
Mdm2基因最初是自发肿瘤鼠Balb/c3T3成纤维细胞系中鉴定出来的,人的Mdm2基因位于12号染色体长臂12q[10],其转录产物mRNA广泛表达于正常人体的多个器官,骨骼肌含量最高,其次为肝、肺、胰等,与细胞基本生理活动有关[11]。Mdm2最重要的作用是抑制wtP53基因的激活转录功能和抗肿瘤活性。其主要通过与P53形成复合物或加速P53的分解,而高水平的Mdm2基因产物本身也可以使P53的功能失活,抑制P53的功能,对P53起负调节的作用[12]。已有研究结果表明,Mdm2与一些肿瘤的发生发展密切相关[13]。Mdm2基因编码的P90蛋白能够与P53基因结合,使P53基因失去正常功能,导致肿瘤的发生。Mdm2基因突变或表达异常将导致平衡的破坏,可能与细胞转化和肿瘤的发生有关,Mdm2除抑制抑癌基因P53产生,其本身也有致癌作用。Mdm2在细胞转化过程中起癌基因作用的证据很多[14]。
本文结果显示,乳腺癌组织中Mdm2的表达要明显高于正常对照组,Mdm2的表达随Robson临床分期增高而增加,有淋巴结转移者Mdm2表达要高于无淋巴结转移者,Mdm2过度表达与乳腺癌的直径大小无相关性,与临床分期相关,提示Mdm2可促进肿瘤细胞向恶性化方向分化,并促进肿瘤的进展。有淋巴结转移患者乳腺癌组织癌细胞中,P53染色阳性率明显增高,说明乳腺癌细胞P53的过度沉积可诱导或促进肿瘤的浸润和转移。在本组中,Mdm2与P53两者有一致性(χ2=2.9,P=0.09),提示二者在乳腺癌发生、发展中起协同作用,共同参与乳腺癌进程。当然,二者亦可能有各自独立的作用过程,通过不同机制促进乳腺癌的发展,目前仍需进一步研究。
参考文献
[1] 史爱学,杨举轮.P53基因治疗恶性肿瘤的现状与趋势.西南国防医药,2004,14(1):101-103.
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[3] ShinizuM,Saitoh Y,Itoh H.Imm unoh istochem ical staining of Haras oncogene product in normal,begin,and m alignant human pancreatic tissues.Human Pathol,1990,21(6):607-612.
[4] 金焰,傅松滨.肿瘤抑制基因P53与肿瘤关系以及基因治疗的研究进展.国外遗传学分册,2001,24(4):201-206.
[5] 王朝霞,束永前.重组腺病毒P53基因治疗肺癌的研究进展.中国肺癌杂志,2005,8(2):148-151.
[6] 张爱菊,齐云飞.P53基因与人类肿瘤基因治疗研究进展.医学综述,2002,8(11):630-632.
[7] PorterA,GownAN,Kramp sg,et alWidespread P53 overexpression in human m alignant tumor.AM J Pathol,1992,140(1):145-148.
[8] Ichimiya S,Nimura Y,et al Mutation,allelotypin and transcription analyses of the P53 gene in prostatic carcinoma.Cancer Bes 1998,58(10):2076.
[9] Storey A,ThomasM,KalitaA,et al Role of a P53 polymorphisn in the developm ent of human an papilkm avirus-associated carcinoma.Nature,1998,393(6682):229.
[10] Oliner JD,Kinzler KW,Meltzer PS,et al Amplification of a gene encoding a P53 associated protein in human an sarcom as.Nature,1992,358(6381):80-83.
[11] 赵劲风.肝癌组织中P53基因及其下游基因的研究进展.中国现代医学杂志,2003,13(24):70-73.
[12] HU H,XIA SH,LIAD.A ssociation of P53 with proliferative potential in normal and neoplastic human an keratinocytes.Invest Dematol,1999,113:1099-1105.
[13] Weissm an AM.Them es and variations on ubiquitylation.Nat Rev MolCellBio,2001,2(3):169-178.
[14] Turb in DA,Cheang MC,Baidik CD.MDM2protein expression is a negative prognostic marker in breast carcinoma.Mod Patho,2006,19(1):69-74.