【摘 要】
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目的 对ITGB3基因新的终止突变c.1476G＞A进行体外表达研究,以阐明其功能.方法 应用体外定点诱变技术构建突变型ITGB3 c.1476G＞A cDNA的真核表达载体,转化感受态细胞,提取质粒后
【机 构】
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浙江省血液中心输血研究所、卫生部血液安全研究重点实验室浙江省血液安全研究重点实验室,杭州,310006
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目的 对ITGB3基因新的终止突变c.1476G＞A进行体外表达研究,以阐明其功能.方法 应用体外定点诱变技术构建突变型ITGB3 c.1476G＞A cDNA的真核表达载体,转化感受态细胞,提取质粒后测序验证.采用非脂质体介导重组质粒转染中国仓鼠卵巢癌细胞株(Chinese hamster ovarian cancer,CHO)细胞,经G418筛选获取稳定表达细胞株.采用实时荧光定量PCR、Western印迹和流式细胞术分别检测CHO稳定表达株ITGB3基因的mRNA表达和血小板膜糖蛋白Ⅲa(glycoproteinⅢa,GPⅢa)糖蛋白水平.结果 成功构建野生型和突变型ITGB3 cDNA的真核表达载体,转染筛选后分别获得了稳定表达的CHO细胞株.突变型细胞株中CD61抗原表达量仅为野生型的37％,而ITGB3 mRNA转录水平为野生型的6％.Western印迹结果显示,野生型细胞株稳定表达完整的GPⅢa蛋白,而突变型CHO细胞株无完整的GPⅢa蛋白表达.结论ITGB3 c.1476G＞A终止突变可导致ITGB3基因的转录水平降低,影响GPⅢa蛋白合成及CD61抗原的表达水平.
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