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目的建立高效液相色谱-串联质谱法同时定性和定量分析复合维生素片中叶酸和生物素的方法。方法样品用水溶液溶解,经Eclipse C18色谱柱(2.1 mm×100 mm,1.8μm)分离,流动相为0.1%甲酸溶液和乙腈梯度洗脱,流速0.2 ml/min,采用电喷雾离子源正离子模式,多反应监测(MRM)进行检测。结果叶酸和生物素在5 min内得到较好的分离。叶酸和生物素的线性范围分别为42~523和47~583 ng/ml,线性回归方程分别为y=1157.63x-6698.38(r~2=0.999 9)和y=207.93x-3052.26(r~2=0.998 2),低、中、高3个添加水平的回收率分别为99.9%~108.7%和90.1%~94.5%,相对标准偏差(RSD)均为1.0%(n=6),检出限分别为0.33和0.08μg/g。结论高效液相色谱-串联质谱法可靠、灵敏、准确,可用于复合维生素片中叶酸和生物素同时定性和定量分析。