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摘 要：为从病理学角度阐明三疣梭子蟹（Portunus trituberculatus）“乳化病”的致病机理，选取中度和重度感染“乳化病”的三疣梭子蟹进行了病理研究。结果显示：河北省黄骅地区池塘养殖三疣梭子蟹“乳化病”的致病病原为血卵涡鞭虫（Hematodinium sp.）;患病三疣梭子蟹的血淋巴、心脏、肝胰腺、鳃、体肌肉、螯足、第一步足和性腺等重要的组织器官均会受到不同程度的破坏。中等程度感染的病蟹多数组织器官尚存比较完整的组织结构;而重度感染的病蟹组织器官被严重破坏，其中肝胰腺和螯足肌肉已经失去原有组织结构，性腺也几乎完全消失。
关键词：三疣梭子蟹（Portunus trituberculatus）;“乳化病”;病理;血卵涡鞭虫（Hematodinium sp.）
三疣梭子蟹（Portunus trituberculatus）是河北省的传统养殖品种，具有较高的知名度和产业优势。但近几年“乳化病”的爆发给产业带来了巨大影响，导致养殖户亏损严重、养殖面积锐减。笔者对该病进行了病理研究，以期从病理学角度阐明该病的致病机理，为寻找该病的有效防控方法提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 样品采集
病蟹采样时间为2020年10月1日，采样地点为黄骅市南排河镇北方第一渔村。发病池塘的养殖模式为三疣梭子蟹与日本对虾混养，其中，三疣梭子蟹的雄蟹已经在9月份出塘售卖，塘中存蟹为育肥雌蟹，发病个体也均为雌蟹。发病池塘水色呈褐绿色，藻色偏淡，透明度在40～50 cm，水温15 ℃。养殖业者介绍，该池塘在近几天发病明显（蟹的活力下降、死亡明显增加），而隔壁池塘（也是该养殖户的池塘）的蟹在前几天已经全部死亡。这两口池塘在出塘雄蟹时均未见发病，同池养殖的日本对虾也未见发病。
取中等程度发病和重度发病的病蟹放入泡沫箱中，加少量冰块降温，运回实验室进行病原、病理研究。
1.2 制作血涂片
用 75%酒精对梭子蟹步足基部擦拭消毒， 用1 mL无菌注射器于其關节膜处抽取约200 μL血淋巴，滴于载玻片上，混合等量的中性红溶液（中性红：PBS=0.02% w/v），在显微镜下进行观察并拍照。
1.3 制作病理切片
取病蟹的鳃、肝胰腺、心脏、体肌肉、螯足、第一步足和性腺等7种组织，Bouin氏液固定24 h，自来水冲洗12 h，经70%、80%、85%、90%、95%、100%酒精逐级脱水后，二甲苯+酒精、二甲苯透明，浸蜡，石蜡切片，H.E染色，显微观察、拍照。
2 结果与讨论
2.1 结果
2.1.1 病蟹的外观症状 病蟹甲长为6.7～7.3 cm，甲宽为14.3～15.6 cm，体重为97～106 g;与同等规格健康蟹相比，病蟹体重明显偏轻（轻约20%左右）。具体外观症状见图1（封二）。患病个体活力差，爬行缓慢、螯足无力，体色暗淡，体表有藻类、有机物等附着物（蟹的自净能力下降）。解剖观察，发病严重的蟹体内充满乳白色（微黄）浓稠液体，肝胰腺明显偏小且颜色偏白，性腺严重萎缩或乳化（有的病蟹几乎找不到性腺）;病蟹的螯足和步足空瘪，肌纤维间有水样物;心脏被乳白色液体包裹，心肌弹性差;鳃呈灰褐色。
2.1.2 血涂片观察 血淋巴涂片检查显示，在病蟹血淋巴中有大量病原—血卵涡鞭虫（Hematodinium sp.），该寄生虫在血淋巴中主要以多核滋养体和团聚体的形态存在，见图2（封二）。
2.1.3 组织病理变化
2.1.3.1 鳃 病蟹鳃的切片显示，鳃丝腔内充斥着大量血卵涡鞭虫虫体，其中，以多核滋养体为主，部分鳃丝腔内出现蛛网状滋养体;中度感染的病蟹鳃丝基本完整，但部分鳃小隔消失;重度感染的鳃丝管腔膨胀变形，鳃丝末端的鳃小片膨胀变形，鳃小隔完全缺失。见图3（封二）。
2.1.3.2 肝胰腺 中度感染时，病蟹肝胰脏中有大量血卵涡鞭虫进入肝小管间隙，肝小管间隙明显增大，结缔组织几乎完全缺失，但肝胰脏整体结构尚在;重度感染时，肝胰脏组织结构完全被破坏，绝大部分肝小管消失，仅存少量肝小管轮廓。见图4（封三）。
2.1.3.3 心脏 中度感染的病蟹，心脏基本组织结构完整，部分心肌纤维溶解断裂，肌束间隙增大，肌丝纤维互相分离;重度感染的病蟹心脏，大量心肌纤维弯曲、断裂、溶解坏死，肌丝纤维相互分离，丧失原本的条带结构，肌纤维间结缔组织完全破损缺失，心脏内充满虫体。见图5（封三）。
2.1.3.4 体肌肉 中度感染血卵涡鞭虫的病蟹体肌肉，部分组织结构完整，部分肌丝断裂溶解，肌丝纤维排列疏松，相邻肌丝纤维互相分离，间隙中侵入大量的血卵涡鞭虫;重度感染的病蟹体肌肉，大量肌肉组织变性坏死，肌丝排列紊乱且相互分离，大部分肌丝纤维弯曲、断裂、溶解，丧失正常紧密的条带状结构，坏死部分充满血卵涡鞭虫体。见图6（封三）。
2.1.3.5 螯足 中度感染血卵涡鞭虫的病蟹螯足肌肉，组织结构基本完整，部分肌丝断裂溶解，间隙中侵入大量的血卵涡鞭虫;重度感染的病蟹螯足肌肉，大量肌肉组织变性坏死，肌丝排列紊乱且相互分离，大部分肌丝纤维弯曲、断裂、溶解，几乎失去原有组织结构。见图7（封三）。
2.1.3.6 第一步足 中度感染的病蟹第一步足肌肉，部分组织结构完整，部分肌丝断裂溶解，间隙中侵入大量的血卵涡鞭虫;重度感染的病蟹第一步足肌肉，大量肌肉组织变性坏死，肌丝排列紊乱且相互分离，大部分肌丝纤维弯曲、断裂、溶解，留下大片空白处，几乎失去原有组织结构。见图8（封三）。
2.1.3.7 性腺 中度感染血卵涡鞭虫的病蟹性腺非常小，萎缩明显，病理切片观察，性腺已经完全失去其原有组织结构，仅存少量卵母细胞轮廓，性腺内部充满血卵涡鞭虫虫体;重度感染的病蟹已经完全找不到性腺，性腺已经完全乳化或萎缩。见图9（封三）。 2.2 討论
本次采样的病蟹外观症状与许文军等[1-2]、王印庚等[3]所描述的症状相似，该病也有 “肌肉白浊症”“牛奶病”和“牙膏病”等称谓，各种命名均是依据其主要症状（肌肉和肝胰腺等组织被乳化呈白色或淡黄色液体）而来。
血卵涡鞭虫被认为是一类感染海水甲壳类的寄生性甲藻（parasitic dinoflagellates）[4]。本研究在病蟹血淋巴、乳化液体、鳃、肝胰脏、心脏、体肌肉、螯足肌肉、第一步足肌肉等组织器官内发现了大量血卵涡鞭虫，观察到了该寄生虫的多核滋养体、单核滋养体、丝状滋养体、类变形虫滋养体、团聚体、蛛网状滋养体和孢子前细胞等各个发育时期的虫体，这一结果与王金凤等[5]的研究一致。血卵涡鞭虫在宿主体内的系统性感染增殖导致宿主的主要器官和组织均发生不同程度的病变，本研究采样的血淋巴、心脏、肝胰腺、鳃、体肌肉、螯足、第一步足和性腺等重要的组织器官均受到不同程度的破坏。各组织器官被破坏的程度与血卵涡鞭虫感染程度呈正相关，中等程度感染的病蟹多数组织器官尚存比较完整的组织结构，而重度感染（乳化严重）的病蟹体内充满大量乳白色液体，其各组织器官受损也最为明显，部分组织器官（肝胰腺和螯足肌肉）已经失去原有组织结构，性腺也完全消失。
从各组织器官被破坏程度看，肝胰腺、螯足肌肉和体肌肉的损伤最为明显，其次是第一步足肌肉和心脏，鳃的损伤相对最小。性腺组织有些特殊，重度感染的病蟹完全失去了性腺（或性腺未发育），中等程度感染的病蟹仅存疑似性腺，切片显示完全失去性腺原有结构，仅存卵母细胞轮廓。其原因有可能是血卵涡鞭虫的感染能够抑制三疣梭子蟹的性腺发育。本次采样没有雄蟹，没有观察到雄蟹感染后性腺的情况，血卵涡鞭虫对三疣梭子蟹性腺的影响是溶解破坏还是抑制生长还有待于进一步研究。
参考文献：
[1]
许文军，徐汉祥，施惠，等.三疣梭子蟹Portunus trituberculatus（Miers） 血卵涡鞭虫病诊断与综合防治措施[J].现代渔业信息，2006，21（11）：27-28.
[2] 许文军，施慧，徐汉祥，等.养殖梭子蟹血卵涡鞭虫感染的初步研究[J].水生生物学报，2007，31（5）：27-32.
[3] 王印庚，杨洋，张正，等.津冀地区养殖三疣梭子蟹大量死亡的病原和病理分析[J].中国水产科学，2017，24（3）：596-605.
[4] 李才文，许文军.海水甲壳类寄生性病原血卵涡鞭虫（Hematodinium spp.）研究进展[J].海洋与湖沼，2014，45（1）：1-10.
[5] 王金凤，李才文，李蒙，等.血卵涡鞭虫感染三疣梭子蟹的病原形态学及组织病理学变化[J].海洋与湖沼，2015，46（4）：748-757.
（收稿日期：2021-08-05）
关键词：三疣梭子蟹（Portunus trituberculatus）;“乳化病”;病理;血卵涡鞭虫（Hematodinium sp.）
三疣梭子蟹（Portunus trituberculatus）是河北省的传统养殖品种，具有较高的知名度和产业优势。但近几年“乳化病”的爆发给产业带来了巨大影响，导致养殖户亏损严重、养殖面积锐减。笔者对该病进行了病理研究，以期从病理学角度阐明该病的致病机理，为寻找该病的有效防控方法提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 样品采集
病蟹采样时间为2020年10月1日，采样地点为黄骅市南排河镇北方第一渔村。发病池塘的养殖模式为三疣梭子蟹与日本对虾混养，其中，三疣梭子蟹的雄蟹已经在9月份出塘售卖，塘中存蟹为育肥雌蟹，发病个体也均为雌蟹。发病池塘水色呈褐绿色，藻色偏淡，透明度在40～50 cm，水温15 ℃。养殖业者介绍，该池塘在近几天发病明显（蟹的活力下降、死亡明显增加），而隔壁池塘（也是该养殖户的池塘）的蟹在前几天已经全部死亡。这两口池塘在出塘雄蟹时均未见发病，同池养殖的日本对虾也未见发病。
取中等程度发病和重度发病的病蟹放入泡沫箱中，加少量冰块降温，运回实验室进行病原、病理研究。
1.2 制作血涂片
用 75%酒精对梭子蟹步足基部擦拭消毒， 用1 mL无菌注射器于其關节膜处抽取约200 μL血淋巴，滴于载玻片上，混合等量的中性红溶液（中性红：PBS=0.02% w/v），在显微镜下进行观察并拍照。
1.3 制作病理切片
取病蟹的鳃、肝胰腺、心脏、体肌肉、螯足、第一步足和性腺等7种组织，Bouin氏液固定24 h，自来水冲洗12 h，经70%、80%、85%、90%、95%、100%酒精逐级脱水后，二甲苯+酒精、二甲苯透明，浸蜡，石蜡切片，H.E染色，显微观察、拍照。
2 结果与讨论
2.1 结果
2.1.1 病蟹的外观症状 病蟹甲长为6.7～7.3 cm，甲宽为14.3～15.6 cm，体重为97～106 g;与同等规格健康蟹相比，病蟹体重明显偏轻（轻约20%左右）。具体外观症状见图1（封二）。患病个体活力差，爬行缓慢、螯足无力，体色暗淡，体表有藻类、有机物等附着物（蟹的自净能力下降）。解剖观察，发病严重的蟹体内充满乳白色（微黄）浓稠液体，肝胰腺明显偏小且颜色偏白，性腺严重萎缩或乳化（有的病蟹几乎找不到性腺）;病蟹的螯足和步足空瘪，肌纤维间有水样物;心脏被乳白色液体包裹，心肌弹性差;鳃呈灰褐色。
2.1.2 血涂片观察 血淋巴涂片检查显示，在病蟹血淋巴中有大量病原—血卵涡鞭虫（Hematodinium sp.），该寄生虫在血淋巴中主要以多核滋养体和团聚体的形态存在，见图2（封二）。
2.1.3 组织病理变化
2.1.3.1 鳃 病蟹鳃的切片显示，鳃丝腔内充斥着大量血卵涡鞭虫虫体，其中，以多核滋养体为主，部分鳃丝腔内出现蛛网状滋养体;中度感染的病蟹鳃丝基本完整，但部分鳃小隔消失;重度感染的鳃丝管腔膨胀变形，鳃丝末端的鳃小片膨胀变形，鳃小隔完全缺失。见图3（封二）。
2.1.3.2 肝胰腺 中度感染时，病蟹肝胰脏中有大量血卵涡鞭虫进入肝小管间隙，肝小管间隙明显增大，结缔组织几乎完全缺失，但肝胰脏整体结构尚在;重度感染时，肝胰脏组织结构完全被破坏，绝大部分肝小管消失，仅存少量肝小管轮廓。见图4（封三）。
2.1.3.3 心脏 中度感染的病蟹，心脏基本组织结构完整，部分心肌纤维溶解断裂，肌束间隙增大，肌丝纤维互相分离;重度感染的病蟹心脏，大量心肌纤维弯曲、断裂、溶解坏死，肌丝纤维相互分离，丧失原本的条带结构，肌纤维间结缔组织完全破损缺失，心脏内充满虫体。见图5（封三）。
2.1.3.4 体肌肉 中度感染血卵涡鞭虫的病蟹体肌肉，部分组织结构完整，部分肌丝断裂溶解，肌丝纤维排列疏松，相邻肌丝纤维互相分离，间隙中侵入大量的血卵涡鞭虫;重度感染的病蟹体肌肉，大量肌肉组织变性坏死，肌丝排列紊乱且相互分离，大部分肌丝纤维弯曲、断裂、溶解，丧失正常紧密的条带状结构，坏死部分充满血卵涡鞭虫体。见图6（封三）。
2.1.3.5 螯足 中度感染血卵涡鞭虫的病蟹螯足肌肉，组织结构基本完整，部分肌丝断裂溶解，间隙中侵入大量的血卵涡鞭虫;重度感染的病蟹螯足肌肉，大量肌肉组织变性坏死，肌丝排列紊乱且相互分离，大部分肌丝纤维弯曲、断裂、溶解，几乎失去原有组织结构。见图7（封三）。
2.1.3.6 第一步足 中度感染的病蟹第一步足肌肉，部分组织结构完整，部分肌丝断裂溶解，间隙中侵入大量的血卵涡鞭虫;重度感染的病蟹第一步足肌肉，大量肌肉组织变性坏死，肌丝排列紊乱且相互分离，大部分肌丝纤维弯曲、断裂、溶解，留下大片空白处，几乎失去原有组织结构。见图8（封三）。
2.1.3.7 性腺 中度感染血卵涡鞭虫的病蟹性腺非常小，萎缩明显，病理切片观察，性腺已经完全失去其原有组织结构，仅存少量卵母细胞轮廓，性腺内部充满血卵涡鞭虫虫体;重度感染的病蟹已经完全找不到性腺，性腺已经完全乳化或萎缩。见图9（封三）。 2.2 討论
本次采样的病蟹外观症状与许文军等[1-2]、王印庚等[3]所描述的症状相似，该病也有 “肌肉白浊症”“牛奶病”和“牙膏病”等称谓，各种命名均是依据其主要症状（肌肉和肝胰腺等组织被乳化呈白色或淡黄色液体）而来。
血卵涡鞭虫被认为是一类感染海水甲壳类的寄生性甲藻（parasitic dinoflagellates）[4]。本研究在病蟹血淋巴、乳化液体、鳃、肝胰脏、心脏、体肌肉、螯足肌肉、第一步足肌肉等组织器官内发现了大量血卵涡鞭虫，观察到了该寄生虫的多核滋养体、单核滋养体、丝状滋养体、类变形虫滋养体、团聚体、蛛网状滋养体和孢子前细胞等各个发育时期的虫体，这一结果与王金凤等[5]的研究一致。血卵涡鞭虫在宿主体内的系统性感染增殖导致宿主的主要器官和组织均发生不同程度的病变，本研究采样的血淋巴、心脏、肝胰腺、鳃、体肌肉、螯足、第一步足和性腺等重要的组织器官均受到不同程度的破坏。各组织器官被破坏的程度与血卵涡鞭虫感染程度呈正相关，中等程度感染的病蟹多数组织器官尚存比较完整的组织结构，而重度感染（乳化严重）的病蟹体内充满大量乳白色液体，其各组织器官受损也最为明显，部分组织器官（肝胰腺和螯足肌肉）已经失去原有组织结构，性腺也完全消失。
从各组织器官被破坏程度看，肝胰腺、螯足肌肉和体肌肉的损伤最为明显，其次是第一步足肌肉和心脏，鳃的损伤相对最小。性腺组织有些特殊，重度感染的病蟹完全失去了性腺（或性腺未发育），中等程度感染的病蟹仅存疑似性腺，切片显示完全失去性腺原有结构，仅存卵母细胞轮廓。其原因有可能是血卵涡鞭虫的感染能够抑制三疣梭子蟹的性腺发育。本次采样没有雄蟹，没有观察到雄蟹感染后性腺的情况，血卵涡鞭虫对三疣梭子蟹性腺的影响是溶解破坏还是抑制生长还有待于进一步研究。
参考文献：
[1]
许文军，徐汉祥，施惠，等.三疣梭子蟹Portunus trituberculatus（Miers） 血卵涡鞭虫病诊断与综合防治措施[J].现代渔业信息，2006，21（11）：27-28.
[2] 许文军，施慧，徐汉祥，等.养殖梭子蟹血卵涡鞭虫感染的初步研究[J].水生生物学报，2007，31（5）：27-32.
[3] 王印庚，杨洋，张正，等.津冀地区养殖三疣梭子蟹大量死亡的病原和病理分析[J].中国水产科学，2017，24（3）：596-605.
[4] 李才文，许文军.海水甲壳类寄生性病原血卵涡鞭虫（Hematodinium spp.）研究进展[J].海洋与湖沼，2014，45（1）：1-10.
[5] 王金凤，李才文，李蒙，等.血卵涡鞭虫感染三疣梭子蟹的病原形态学及组织病理学变化[J].海洋与湖沼，2015，46（4）：748-757.
（收稿日期：2021-08-05）