【摘 要】
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目的 构建人骨形成蛋白7基因(hBMP7)重组腺相关病毒载体,并观察其在兔骨髓间充质干细胞中的表达.方法 将骨形成蛋白7基因片段克隆入穿梭质粒pUC18获得重组质粒pUC18-hBMP7.Kp
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目的 构建人骨形成蛋白7基因(hBMP7)重组腺相关病毒载体,并观察其在兔骨髓间充质干细胞中的表达.方法 将骨形成蛋白7基因片段克隆入穿梭质粒pUC18获得重组质粒pUC18-hBMP7.Kpn Ⅰ和Sa Ⅱ双酶切质粒pUC18-hBMP7与pSNAV,用T4DNA连接酶连接分别回收的两片段后转化大肠杆菌DH5α感受态细胞,获得重组质粒PSNAV-hBMP7,转染BHK-21细胞,筛选培养,用能表达Rap和Cap的重组Ⅰ型单纯疱疹病毒HSV1-rc/△UL2感染此细胞,裂解细胞收获病毒液.采用氯仿处理-PEG/NaCl沉淀-氯仿抽提法分离浓缩、纯化与测定病毒滴度.用rAAV2-hBMP7和rAAV2-EGFP在体外分别转染兔骨髓间充质干细胞.流式细胞仪、RT-PCR和Western-blot方法检测兔骨髓间充质干细胞中hBMP-7基因的转录和表达.结果 成功构建具有感染活性的重组腺相关病毒载体rAAV2-hBMP7,病毒载体对兔骨髓间充质干细胞早期转染效率可达99.8%,hBMP7在兔骨髓间充质干细胞中可得到转录和表达.结论 成功构建了人骨形成蛋白7基因重组腺相关病毒载体,rAAV2-hBMP7载体在体外可转染兔骨髓间充质干细胞,并获得较高的转染效率.
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