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摘 要：猪流行性腹泻病毒（Porcine Epidemic Diarrhea Virus，PEDV）属于冠状病毒科（Coronaviridae），能引起猪吸收不良性水样腹泻、呕吐、脱水和血液电解质紊乱。自20世纪70年代以来，PED暴发已成为全世界各国养猪生产的主要问题，造成巨大的经济损失。虽然成年猪感染PED不会死亡，但新生哺乳仔猪感染的死亡率可达100%。本研究对PED暴发过后的商业猪场中死亡猪和存活猪的基因组进行了对比分析。采集三个国家（美国、加拿大和德国）五个不同猪场262头猪（商业品系）的样本（其中156头死亡猪样本，106头康复猪样本），以猪80 K SNP 芯片进行基因分型。在死亡和康复猪基因组的1 Mb非重叠区内计算平均Fst值（Fst是表征亚群体间的遗传分化尺度。可以对不同人群之间遗传关系的远近进行量化），计算结果进行均一化（normalized）处理以发现其中的差异。在死亡和康复猪之间，检测到7个检测窗口表现出高度趋异化，其中5个位于2号染色体，1个位于4号染色体，1个位于15号染色体，共含152个基因。其中少数基因在很多病毒感染中过量或过低表达，包括冠状病毒（如非典型性肺炎冠状病毒）。隶属于一个或多个Gene Ontology语义中的32个基因都与PED的感染发展过程有关，如高尔基体，此外，还与恢复或腹泻病情发展（细胞增殖、离子转运、腺苷三磷酸酶活性）的机制相关。综上所述，本文首次从基因图谱分析揭示了哺乳仔猪从PEDV中快速恢复的原因和能力。
关键词：Fst；仔猪；猪流行性腹泻病毒；恢复
中图分类号：S852.21 文献标识码：A 文章编号：1001-0769（2017）05-0044-05
猪流行性腹泻病毒（Porcine Epidemic Diarrhea Virus，PEDV）属于冠状病毒科，该科包含多种能够影响人类和其他动物健康的病毒，可引起动物呼吸系统和胃肠道疾病。与其他许多冠状病毒一样，PEDV的寄主范围有限且具有宿主特异性，只能感染猪的小肠。PEDV感染猪后可引起急性肠道疾病，因为其感染肠道后迅速形成坏死斑，最终导致绒毛萎缩和发展成为吸收不良性水样腹泻、呕吐、脱水和血液电解质紊乱。PEDV感染传播的主要途径为粪便-口腔，甚至是成烟雾状的PEDV仍具有感染的能力。PEDV与其他感染猪的冠状病毒（如传染性胃肠炎病毒，Transmissible Gastroenteritis Virus，TGEV）一样，要通过与ANPEP基因编码的丙酰基氨肽酶互作后方能进入寄主细胞。丙酰基氨肽酶作为PEDV的受体在肠上皮细胞中大量表达，体外实验显示其密度与PEDV病毒的復制速度相关。自20世纪70年代在欧洲发现PEDV病毒以来，PED的暴发已经成为全球养猪生产国中养猪生产的主要问题，同时给猪肉生产商也造成了巨大的经济损失。众所周知，虽然成年猪感染并不致命，但3周龄以下且未免疫的仔猪感染PEDV后会出现严重的疾病，在许多猪场感染猪群的死亡率可达100%。然而，总有一小部分幼小的哺乳仔猪能够从PED暴发后存活下来并恢复正常生长，但其中的缘由和机理却一直未知。但根据所涉及到的生物机制，我们提出两个主要假说：（1）受感染哺乳仔猪的存活可能与PEDV进入小肠上皮细胞所必需的肠道受体（ANPEP）基因发生变异有关；（2）如Schneider和Ayres（2008）与Ayres和Schneider（2012）总结的一样，在PEDV感染中存活和恢复的哺乳仔猪可能与其自身独有的寄主免疫反应有关，这种免疫反应可以提高清除病毒的能力，增加上皮细胞的再生速度或减少病毒复制。
我们在本研究中主要对比商业化生产猪场中PED暴发期间死亡和康复猪的全基因组（genome-wide）差异。以PED暴发的急性高峰期（群体诊断确认后）3周龄以下的哺乳仔猪作为研究对象。由于清群是应对PED暴发的主要措施之一，所以很难获得关于存活率或者真正的样本来验证上述假说。我们共采集262份动物样本，分别来自于三个国家（美国、加拿大、德国）中五个不同猪场的多个商业末端杂交品系。在这些动物样本中，156头死于严重的腹泻和脱水，106头成功地从疾病中恢复（表1）。此外，还收集了一些特定的仔猪样本以使得从每个猪场取得死亡猪和康复猪的数量达到平衡，只有美国的一个农场采样数量不平衡。其中3个猪场（1个位于美国，2个位于德国）中死亡和恢复的仔猪均来自于同窝（即每窝1～2头死猪，1～2头恢复仔猪）。每一头仔猪均采用GeneSeek Genomic Profiler 80 K SNP芯片（含68 517个SNPs） （Geneseek–Neogen）进行基因分型（genotyped）。只有与常染色体的匹配度超过90%的SNPs才予以采纳，用于分析。总的来说，共有57 422 SNPs通过了筛选步骤，滤掉的SNPs归因于所采用的BEAGLE 3.3.3（Browning和Browning，2007）。2009年，Alexander等采用ADMIXTURE软件进行种群分层（population stratification）研究。按照软件的操作说明，采用交叉验证（Cross-Validation，CV）步骤选择模型的最佳K值（K代表用于分析的亚群的数量）。在K的取值范围1～10内，K=8的交叉验证错误率最低，因此将其作为最为灵敏的模型。图1为K=8时的Admixture图。与预测的一致，样本出现层化现象，两个来自于美国猪场的样本表现出较大的相似性。由于每个猪场收集的康复猪数量较少，无法进行同一猪场品系内部或层内种群的进一步分析。因此，我们将重点放在死亡猪和康复猪之间的对比分析上，试图检测u差异的常见间距（common windows of divergence）。采用PLINK1.7对死亡猪和康复猪进行对比分析得到多维尺度变换图（multidimensional scaling plot）（图2）。图2清晰地显示了两个群体之间的差异。为了寻找两个群体间更大的不同，采用Karlsson等（2007）报道的公式计算每一个SNP的Fst值：
关键词：Fst；仔猪；猪流行性腹泻病毒；恢复
中图分类号：S852.21 文献标识码：A 文章编号：1001-0769（2017）05-0044-05
猪流行性腹泻病毒（Porcine Epidemic Diarrhea Virus，PEDV）属于冠状病毒科，该科包含多种能够影响人类和其他动物健康的病毒，可引起动物呼吸系统和胃肠道疾病。与其他许多冠状病毒一样，PEDV的寄主范围有限且具有宿主特异性，只能感染猪的小肠。PEDV感染猪后可引起急性肠道疾病，因为其感染肠道后迅速形成坏死斑，最终导致绒毛萎缩和发展成为吸收不良性水样腹泻、呕吐、脱水和血液电解质紊乱。PEDV感染传播的主要途径为粪便-口腔，甚至是成烟雾状的PEDV仍具有感染的能力。PEDV与其他感染猪的冠状病毒（如传染性胃肠炎病毒，Transmissible Gastroenteritis Virus，TGEV）一样，要通过与ANPEP基因编码的丙酰基氨肽酶互作后方能进入寄主细胞。丙酰基氨肽酶作为PEDV的受体在肠上皮细胞中大量表达，体外实验显示其密度与PEDV病毒的復制速度相关。自20世纪70年代在欧洲发现PEDV病毒以来，PED的暴发已经成为全球养猪生产国中养猪生产的主要问题，同时给猪肉生产商也造成了巨大的经济损失。众所周知，虽然成年猪感染并不致命，但3周龄以下且未免疫的仔猪感染PEDV后会出现严重的疾病，在许多猪场感染猪群的死亡率可达100%。然而，总有一小部分幼小的哺乳仔猪能够从PED暴发后存活下来并恢复正常生长，但其中的缘由和机理却一直未知。但根据所涉及到的生物机制，我们提出两个主要假说：（1）受感染哺乳仔猪的存活可能与PEDV进入小肠上皮细胞所必需的肠道受体（ANPEP）基因发生变异有关；（2）如Schneider和Ayres（2008）与Ayres和Schneider（2012）总结的一样，在PEDV感染中存活和恢复的哺乳仔猪可能与其自身独有的寄主免疫反应有关，这种免疫反应可以提高清除病毒的能力，增加上皮细胞的再生速度或减少病毒复制。
我们在本研究中主要对比商业化生产猪场中PED暴发期间死亡和康复猪的全基因组（genome-wide）差异。以PED暴发的急性高峰期（群体诊断确认后）3周龄以下的哺乳仔猪作为研究对象。由于清群是应对PED暴发的主要措施之一，所以很难获得关于存活率或者真正的样本来验证上述假说。我们共采集262份动物样本，分别来自于三个国家（美国、加拿大、德国）中五个不同猪场的多个商业末端杂交品系。在这些动物样本中，156头死于严重的腹泻和脱水，106头成功地从疾病中恢复（表1）。此外，还收集了一些特定的仔猪样本以使得从每个猪场取得死亡猪和康复猪的数量达到平衡，只有美国的一个农场采样数量不平衡。其中3个猪场（1个位于美国，2个位于德国）中死亡和恢复的仔猪均来自于同窝（即每窝1～2头死猪，1～2头恢复仔猪）。每一头仔猪均采用GeneSeek Genomic Profiler 80 K SNP芯片（含68 517个SNPs） （Geneseek–Neogen）进行基因分型（genotyped）。只有与常染色体的匹配度超过90%的SNPs才予以采纳，用于分析。总的来说，共有57 422 SNPs通过了筛选步骤，滤掉的SNPs归因于所采用的BEAGLE 3.3.3（Browning和Browning，2007）。2009年，Alexander等采用ADMIXTURE软件进行种群分层（population stratification）研究。按照软件的操作说明，采用交叉验证（Cross-Validation，CV）步骤选择模型的最佳K值（K代表用于分析的亚群的数量）。在K的取值范围1～10内，K=8的交叉验证错误率最低，因此将其作为最为灵敏的模型。图1为K=8时的Admixture图。与预测的一致，样本出现层化现象，两个来自于美国猪场的样本表现出较大的相似性。由于每个猪场收集的康复猪数量较少，无法进行同一猪场品系内部或层内种群的进一步分析。因此，我们将重点放在死亡猪和康复猪之间的对比分析上，试图检测u差异的常见间距（common windows of divergence）。采用PLINK1.7对死亡猪和康复猪进行对比分析得到多维尺度变换图（multidimensional scaling plot）（图2）。图2清晰地显示了两个群体之间的差异。为了寻找两个群体间更大的不同，采用Karlsson等（2007）报道的公式计算每一个SNP的Fst值：