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摘要：对宁夏枸杞主要品种psbA-trntH的DNA条形码序列进行分析，从分子水平对枸杞做出鉴定。采用改进CTAB法提取枸杞叶片DNA，利用合成的特异引物对其叶绿体间隔序列进行扩增、克隆，对目的片段测序分析，克隆到枸杞主要品种psbA-trntH片段，并获得其碱基序列（总长为545 bp）。
关键词：枸杞属；psbA-trntH；DNA测序；鉴定
中图分类号：R282.5 文献标识码：A 文章编号：1674-1161（2016）06-0001-03
宁夏枸杞（Lycium barbarum L.）是我国名贵的道地药材，具有抗氧化、抗肿瘤、软化血管、降脂、降糖、生精、保肝、明目、增强人体免疫力等疗效[1-4]。宁夏自20世纪60年代起开展枸杞新品种育种工作，目前宁夏农林科学院自主选育出宁杞1号、宁杞2号、宁杞3号、宁杞5号、宁杞6号、宁杞7号、宁农杞9号等10余个新品种，国内科技工作者也选育出柴杞1号、蒙杞1号、精杞1号等新品种。由于各品种之间常有相同的基原或为近缘，使得它们在外在形态、习性、组织构造以及所含的化学成分方面具有高度的相似性，传统的鉴定方法已难以准确鉴别。以DNA条形码为工具对物种进行快速、准确的识别和鉴定已用于系统学研究和品种的鉴定。近些年来，国内外许多学者都对植物中适合作为DNA条形码的基因序列进行了积极的探索与研究。psbA-trntH基因片段作为植物DNA条形码最大的优势是进化速率快，累积较多变异，从而能更好地鉴别亲缘关系很近的物种[5-8]。目前，利用psbA-trntH基因序列测定鉴定宁夏枸杞品种的研究还未见报道，因此，本课题以宁夏枸杞主要品种为试材，对枸杞psbA-trntH基因片段序列进行分析研究，以期为从分子水平鉴定枸杞品种提供参考。
1 材料与方法
1.1 试验材料
供试材料为收集保存在宁夏农林科学院枸杞中心枸杞种质资源圃内的枸杞主要品种（见表1）。
1.2 试验仪器
PCR仪：Bio-Rad公司；DYY-12型电泳仪：北京六一仪器厂；DYCp231型电泳槽：北京六一仪器厂； UV-2550紫外可见分光光度仪；TOMOS3-18R Refrigerated Centrifuge；Alpha lnnotech凝胶成像仪；AxyPrep DNA凝胶回收试剂盒：Tiangen公司。
1.3 试验方法
1.3.1 基因组总DNA的提取 参照文献[9]的方法进行。
1.3.2 引物设计 依据GenBank数据库中已发表的茄科植物nrDNA ITS序列，采用测序引物设计的软件Premier 5.0设计引物。AHf：5，-GTTATGCATGAACGTAATGCTC-3；AHr：5，-CGCGCATGGTG
GATTCACAATCC-3。引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成。
1.3.3 目的基因的克隆及测序 以上述引物对7个供试材料的基因组DNA基因PCR扩增，反应体系15.0 μL：7.5 μL 2×Mix混合液，上下游引物各0.5 μL，2.0 μL模板DNA，4.5 μL ddH2O。PCR反应程序为：1） 94 ℃预变性3 min；2） 94 ℃变性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，36次循环；3） 72 ℃保温10 min；4） 4 ℃保存。PCR产物进行1.0%琼脂糖凝胶电泳，用DNA胶回收试剂盒对约550 bp的目标条带进行回收。将回收产物与Lethal Based Fast Cloning Kit连接，T4 DNAlrgse，转入大肠杆菌，采用蓝白斑法筛选阳性菌落。对阳性菌落进行PCR检测后，送往生工生物工程公司（上海）完成。
1.3.4 序列分析 序列分析在NCBI网站及使用DNAMAN，DNAstar软件进行。
2 结果与分析
利用DNAMAN软件将试验测得的宁夏枸杞主要品种psbA-trntH序列与NCBI数据库中已发表的psbA-trntH进行同源性比较，并对所测得的序列进行对位排列，结果如图1所示。
8个供试材料整个ITS序列长度变异范围为545 bp，仅有宁杞3-2号有变异，变异位点9个，变异率1.7%，宁杞1，2，3-1，4，5，6，7号这7个没有差异。
3 结论与讨论
虽然DNA分子标记技术应用于枸杞属植物鉴定等方面已有一些报道[10-11]，但目前植物性中药材的基因组序列绝大多数没有测定，尤其是枸杞序列国内未见报道。本课题利用psbA-trntH基因片段的保守区序列，自行设计引物扩增出整个psbA-trntH基因片段，并完成了扩增产物的DNA碱基序列的测定，得到7个枸杞主要品种psbA-trntH基因片段的完整序列，经过分析能够鉴定出供试材料之间的差异，但是否可利用psbA-trntH基因片段序列在分子生物学水平对枸杞品种进行鉴定有待进一步筛选和研究。
参考文献
[1] 匡可任，路安民.中国植物志（茄科）[M].北京：科学出版社，1978.
[2] 安巍，焦恩宁，石志刚，等.枸杞规范化栽培及加工技术[M].北京：金盾出版社，2005.
[3] 曹有龙.大果枸杞（宁杞3号）栽培技术[M].宁夏：宁夏人民出版社，2006.
[4] 李润淮.枸杞高产栽培技术[M].北京：中国盲文出版社，2000.
[5] 陈士林，姚辉，宋经元，等.基于DNA barcoding（条形码）技术的中药材鉴定[J].世界科学技术，2007，9（3）：7-12.
[6] 陈士林.中药DNA条形码分子鉴定[M].北京：人民卫生出版社，2012.
[7] 宁淑萍，颜海飞，郝刚，等.植物DNA条形码研究进展[J].生物多样性，2016（5）：417-425.
[8] 刘宇靖，刘越，黄耀江，等.植物DNA条形码技术的发展及应用[J].植资源与环境学报，2011，20（1）：74-82，93.
[9] SCOTT O R，AMOLD J.Extraction of DNA from milligram amounts of frest herbarium and mummified plant tissues[J].Plant Molecular Biology，1985（5）：69.
[10] ZHANG KYB，LEUNG HW，YEUNG HW，et al.Differentiation of Lycium bararum from its related Lycium species using random amplified polymorphic DNA[J].PlantaMed，2001（67）：379.
[11] CHENG KT，CHANG HC，HUANG H，et al.RAPD analysis of Lyciumbararum medicine in Taiwan market[J].Bot Bull Acad Sin，2000（41）：11.
关键词：枸杞属；psbA-trntH；DNA测序；鉴定
中图分类号：R282.5 文献标识码：A 文章编号：1674-1161（2016）06-0001-03
宁夏枸杞（Lycium barbarum L.）是我国名贵的道地药材，具有抗氧化、抗肿瘤、软化血管、降脂、降糖、生精、保肝、明目、增强人体免疫力等疗效[1-4]。宁夏自20世纪60年代起开展枸杞新品种育种工作，目前宁夏农林科学院自主选育出宁杞1号、宁杞2号、宁杞3号、宁杞5号、宁杞6号、宁杞7号、宁农杞9号等10余个新品种，国内科技工作者也选育出柴杞1号、蒙杞1号、精杞1号等新品种。由于各品种之间常有相同的基原或为近缘，使得它们在外在形态、习性、组织构造以及所含的化学成分方面具有高度的相似性，传统的鉴定方法已难以准确鉴别。以DNA条形码为工具对物种进行快速、准确的识别和鉴定已用于系统学研究和品种的鉴定。近些年来，国内外许多学者都对植物中适合作为DNA条形码的基因序列进行了积极的探索与研究。psbA-trntH基因片段作为植物DNA条形码最大的优势是进化速率快，累积较多变异，从而能更好地鉴别亲缘关系很近的物种[5-8]。目前，利用psbA-trntH基因序列测定鉴定宁夏枸杞品种的研究还未见报道，因此，本课题以宁夏枸杞主要品种为试材，对枸杞psbA-trntH基因片段序列进行分析研究，以期为从分子水平鉴定枸杞品种提供参考。
1 材料与方法
1.1 试验材料
供试材料为收集保存在宁夏农林科学院枸杞中心枸杞种质资源圃内的枸杞主要品种（见表1）。
1.2 试验仪器
PCR仪：Bio-Rad公司；DYY-12型电泳仪：北京六一仪器厂；DYCp231型电泳槽：北京六一仪器厂； UV-2550紫外可见分光光度仪；TOMOS3-18R Refrigerated Centrifuge；Alpha lnnotech凝胶成像仪；AxyPrep DNA凝胶回收试剂盒：Tiangen公司。
1.3 试验方法
1.3.1 基因组总DNA的提取 参照文献[9]的方法进行。
1.3.2 引物设计 依据GenBank数据库中已发表的茄科植物nrDNA ITS序列，采用测序引物设计的软件Premier 5.0设计引物。AHf：5，-GTTATGCATGAACGTAATGCTC-3；AHr：5，-CGCGCATGGTG
GATTCACAATCC-3。引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成。
1.3.3 目的基因的克隆及测序 以上述引物对7个供试材料的基因组DNA基因PCR扩增，反应体系15.0 μL：7.5 μL 2×Mix混合液，上下游引物各0.5 μL，2.0 μL模板DNA，4.5 μL ddH2O。PCR反应程序为：1） 94 ℃预变性3 min；2） 94 ℃变性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，36次循环；3） 72 ℃保温10 min；4） 4 ℃保存。PCR产物进行1.0%琼脂糖凝胶电泳，用DNA胶回收试剂盒对约550 bp的目标条带进行回收。将回收产物与Lethal Based Fast Cloning Kit连接，T4 DNAlrgse，转入大肠杆菌，采用蓝白斑法筛选阳性菌落。对阳性菌落进行PCR检测后，送往生工生物工程公司（上海）完成。
1.3.4 序列分析 序列分析在NCBI网站及使用DNAMAN，DNAstar软件进行。
2 结果与分析
利用DNAMAN软件将试验测得的宁夏枸杞主要品种psbA-trntH序列与NCBI数据库中已发表的psbA-trntH进行同源性比较，并对所测得的序列进行对位排列，结果如图1所示。
8个供试材料整个ITS序列长度变异范围为545 bp，仅有宁杞3-2号有变异，变异位点9个，变异率1.7%，宁杞1，2，3-1，4，5，6，7号这7个没有差异。
3 结论与讨论
虽然DNA分子标记技术应用于枸杞属植物鉴定等方面已有一些报道[10-11]，但目前植物性中药材的基因组序列绝大多数没有测定，尤其是枸杞序列国内未见报道。本课题利用psbA-trntH基因片段的保守区序列，自行设计引物扩增出整个psbA-trntH基因片段，并完成了扩增产物的DNA碱基序列的测定，得到7个枸杞主要品种psbA-trntH基因片段的完整序列，经过分析能够鉴定出供试材料之间的差异，但是否可利用psbA-trntH基因片段序列在分子生物学水平对枸杞品种进行鉴定有待进一步筛选和研究。
参考文献
[1] 匡可任，路安民.中国植物志（茄科）[M].北京：科学出版社，1978.
[2] 安巍，焦恩宁，石志刚，等.枸杞规范化栽培及加工技术[M].北京：金盾出版社，2005.
[3] 曹有龙.大果枸杞（宁杞3号）栽培技术[M].宁夏：宁夏人民出版社，2006.
[4] 李润淮.枸杞高产栽培技术[M].北京：中国盲文出版社，2000.
[5] 陈士林，姚辉，宋经元，等.基于DNA barcoding（条形码）技术的中药材鉴定[J].世界科学技术，2007，9（3）：7-12.
[6] 陈士林.中药DNA条形码分子鉴定[M].北京：人民卫生出版社，2012.
[7] 宁淑萍，颜海飞，郝刚，等.植物DNA条形码研究进展[J].生物多样性，2016（5）：417-425.
[8] 刘宇靖，刘越，黄耀江，等.植物DNA条形码技术的发展及应用[J].植资源与环境学报，2011，20（1）：74-82，93.
[9] SCOTT O R，AMOLD J.Extraction of DNA from milligram amounts of frest herbarium and mummified plant tissues[J].Plant Molecular Biology，1985（5）：69.
[10] ZHANG KYB，LEUNG HW，YEUNG HW，et al.Differentiation of Lycium bararum from its related Lycium species using random amplified polymorphic DNA[J].PlantaMed，2001（67）：379.
[11] CHENG KT，CHANG HC，HUANG H，et al.RAPD analysis of Lyciumbararum medicine in Taiwan market[J].Bot Bull Acad Sin，2000（41）：11.