【摘 要】
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为了利用CRISPR/Cas9技术高通量筛选介导猪瘟病毒入侵的功能性受体,试验首先用融合PCR技术,将Venus基因融合至Npro蛋白的第13位与14位氨基酸之间,获得全长感染性克隆pCSFV-Ve
【机 构】
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中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室,哈尔滨150069
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为了利用CRISPR/Cas9技术高通量筛选介导猪瘟病毒入侵的功能性受体,试验首先用融合PCR技术,将Venus基因融合至Npro蛋白的第13位与14位氨基酸之间,获得全长感染性克隆pCSFV-Venus;之后将pCSFV-Venus转染至SK6细胞拯救重组猪瘟病毒(rCSFV-Venus),并将拯救的病毒感染猪肾细胞(PK-15细胞)进行连续传代观察其稳定性;最后将rCSFV-Venus和表达EGFP的重组病毒rCSFV-EGFP以相同剂量感染PK-15细胞,通过流式细胞仪分析荧光强度及感染效率.结果 表明:rCSFV-Venus全长感染性克隆构建成功;转染后传至第4代可观察到绿色荧光,表明重组病毒拯救成功;将拯救的病毒连续传代10代,每代感染的PK-15细胞都可观察到绿色荧光,表明重组病毒具有良好的稳定性;流式细胞仪分析结果表明,rCSFV-Venus比rCSFV-EGFP荧光强度强且感染效率高.说明本研究成功拯救了稳定表达Venus基因的rCSFV-Venus,为筛选介导CSFV入侵的功能性受体提供了有力工具.
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