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摘 要：综述了蝴蝶兰组织培养过程中产生褐变的机理及减少褐变的控制措施，如外植体的选择，温度、光照、pH的最适状态，采用抗褐变剂和热激处理等。
关键词：蝴蝶兰；组培；褐变
中图分类号：S682.31 文献标识码：A
蝴蝶兰素有“洋兰王后”之美称，深受消费者的追捧，经济价值极高。但因其为单轴型兰花，一生只产生1条主茎和1个生长点，常规的分株方式繁殖难以进行，因此蝴蝶兰种苗的大规模生产繁殖常采用组织培养、无菌播种的方法。可是无论是组织培养还是无菌播种，在培育幼苗的过程中都会有褐变现象的发生，这在一定程度上影响了培苗的产量和质量。本文系统地综述了蝴蝶兰人工繁殖过程中发生褐变的机理及各种行之有效的控制措施，以期望为广大从事蝴蝶兰繁殖工作者提供帮助。
1 褐变的机理
褐变是指在人工繁殖过程中，蝴蝶兰从自身表面不断向培养基释放褐色物质，最终使培养基变成褐色，反过来毒害自身导致其死亡的一种现象。现在理论上认为褐变现象的发生，是由于人们在建立外植体无菌体系时破坏了切口附近的细胞膜结构，使得原本被质膜分隔在完整组织以及细胞中的酚类化合物外溢与多酚氧化酶（PPO）相遇，2者在有氧条件下于切口表面发生催化反应形成棕褐色的醌类物质和水，而醌类物质在酶的作用下会与蛋白质发生聚合形成黑褐色物质羟醌与黑色素等物质[1]。正是由于这些黑褐色物质的存在，组织中其他酶的活性受到了抑制，从而引起代谢活动紊乱导致组织生长停滞最终死亡。同理，这也说明了为什么正常的蝴蝶兰组织中，底物、氧气、PPO也同时存在但却并不发生褐变的原因。
2 褐变与相关酚类及酶类的关系
由褐变机理可以看出，褐变现象是一个复杂的生理代谢过程，其发生必须具备3个条件即底物、酶和氧。褐变的天然底物是酚类，而催化酚酸类物质合成和氧化的酶则分别是苯丙氨酸解氨酶（PAL）和PPO，氧则是由过氧化物酶（POD）利用切割时释放的H2O2催化产生。因此，褐变与酚类、相关酶类应该有一定的关系。如许传俊[2]等通过观察蝴蝶兰叶外植体褐变后的细胞亚显微结构分析得出，褐变是由于细胞膜系统遭到破坏，酶、酚发生相互作用产生对细胞有毒害物质，最終导致细胞死亡培养失败的。印芳[3]等利用高效液相色谱法对3个褐化的蝴蝶兰品种A1（大白花红心）、B3（迷你型白花黄心）和R4（深红花红心）所含的9种酚酸进行了分析，结果表明：香豆酸对蝴蝶兰褐变有重要影响；绿原酸、邻苯二酚、咖啡酸可能与蝴蝶兰褐变有相关性；苯甲酸对蝴蝶兰褐变影响很小或没有；PAL和PPO活性与褐变程度呈正相关，POD与褐变有很大关系；总酚含量与PAL活性呈正相关，与PPO和POD活性呈负相关。赵滢[4]等以褐变的蝴蝶兰品种B3、15（迷你型深紫红花圆瓣）和F5（亮黄花淡紫斑纹橘黄唇）为试材，对叶片外植体组培过程中酚类物质代谢及活性氧代谢的相关指标进行了测定，结果表明：总酚含量与PAL、POD活性呈正相关；总酚含量最低的B3褐变程度最严重，PPO活性及丙二醛（MDA）含量始终最高；总酚含量最高的F5褐变程度最轻，PPO活性及丙二醛含量也最低，但F5的超氧化物歧化酶（SOD）和抗坏血酸过氧化物酶（APX）活性在整个培养过程中始终最高。
由上述看出，褐变的发生可能是由于切割伤害造成了活性氧代谢失调，引起膜脂过氧化程度加强，导致细胞膜的完整性被破坏，从而使PPO与酚类物质接触最终酚类物质氧化成醌并聚合而产生褐变。总体来说，蝴蝶兰叶片外植体组培褐变程度与总酚含量有一定相关性，PAL和PPO活性与褐变程度呈正相关，与PPO和POD活性呈负相关，SOD和APX作为抗氧化酶清除了蝴蝶兰组培过程中的活性氧，减轻了膜系统损伤程度。
3 控制蝴蝶兰组培褐变的措施
3.1 外植体的选择
外植体的取材时间、部位、大小及发育阶段都影响着褐变的发生。一般外植体应选择生长旺盛的组织或器官，这样的外植体有很强的分生能力，抵抗褐变的能力强。根尖、茎尖、叶片、花梗芽、花梗节间等器官均可作为蝴蝶兰组培快繁外植体，但各有优劣。如李进进[5]等认为根尖虽不易褐变，但不可较好的分化，相比较茎尖分生较强，容易脱分化并再分化成完整植株组培褐变较轻，其中以0.3cm长的茎尖效果最佳。顾伟民[6]等研究表明，花梗侧芽的成活率最高达75%，花梗成活率62.5%，叶片和根尖最差分别为12.5%和7.5%。外植体的大小会也会影响褐变程度。如杨美纯[7]等研究发现1.0cm×1.0cm的叶块褐变较轻分化也较佳，0.5cm×0.5cm的叶块接种后褐变速度快，培养到第50d时褐变率达100%。外植体越老木质素含量越高越易褐化。如杨海芸[8]等以不同叶龄的叶片为外植体接种发现，取叶龄45d的试管苗为外植体组培褐变最轻，30d次之，60d褐变最重。
对于取材时间，一般选择在早春和秋季进行。因为夏季材料褐变严重，冬季的芽不易生长。如张忠和[9]研究指出，6～8月份高温季节采芽进行组织培养褐变严重，组培成功率很低。还有在切割时，应尽量不要产生较大的伤口面积，并注意减少其与空气接触的时间。如Bonga[10]认为外植体越小，切面与体积的比率越大，伤害及褐变的程度就越大。
3.2 培养条件光照、温度和pH的选择
由于参与褐变发生的酶系统活性受光照和温度的影响，因此为减轻褐变外植体材料接种后在培养初期应保持低温（0～15℃），黑暗或弱光下条件下。如余慧琳[11]等研究表明，把花梗节段或是花梗腋芽的外植体先在黑暗环境中培养1周，再转入光强2000lx下正常培养，结果发现它们都比直接放在2000lx条件下培养的褐变轻，并且褐变发生的时间也得到了推迟。尤海波[12]等分别采用暗培养、30lx光照、1200lx光照，7d后调查发现褐化率随着光照强度的增加而增加。赵伶俐[13]等利用不同温度的对蝴蝶兰外植体进行处理，实验发现接种12d后，20℃褐化颜色最浅，25℃褐化较重褐化部分大部分只集中在切口附近，30℃褐化最多达到70%，褐色最深且已经扩散至整个培养基，从而说明外植体褐化率高低与温度高低成正比。 就pH而言，中性偏酸的培养基有利于降低褐化率。如赵伶俐[13]等研究发现pH5.0褐化率最高水平，褐化率达到32.2%；pH6.5的褐化率最轻，仅为4.4%；pH5.0、5.5、6.0的3种培养基，褐化开始时褐色物质就扩散至整个培养基，pH6.5和7.0中主要集中在外植体边缘褐化且色深。尤海波[12]等将培养基的pH分别设定分为5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8，接种7d后调查褐化率，30d后调查诱导率，通过综合分析不同pH下的褐化率和诱导率，发现培养基设为pH5.6的蝴蝶兰褐化较轻诱导率较高。
3.3 培养基的选择
培养基中添加的激素、金属离子以及不同的培养基形态都会对褐变是否发生及发生程度产生影响。如杨海芸[8]研究发现，添加TDZ的基础培养基与添加6-BA相比外植体褐变较少，培养2个月后外植体仍能保持鲜绿色。李冬杰[14]等研究发现添加6-BA过多会使组织严重褐化。印芳[15]等研究了Fe、K、Ca、Zn、Cu等矿质元素不同浓度对蝴蝶兰组培褐变发生概率的影响，结果表明培养基中随着K、Ca、Zn浓度的升高褐变减轻，而随着Fe、Cu浓度的升高褐化加重。
许传俊[16]等分别利用了纸桥培养基和固体培养基培养蝴蝶兰叶片外植体，对比褐变情况发现，MS纸桥培养基培养的外植体褐变较固体培养基MS、B5、N6的轻。陈菁婴[17]等认为培养叶片最好使用液体培养基，因为这样有毒物质可以很快扩散，从而减少对组织的毒害减轻褐变。
3.4 其他因素
3.4.1 使用抗褐变剂
利用抗氧化剂、抑制剂、吸附剂、椰子汁等物质也可抑制蝴蝶兰组培外植体的褐变。如陈冬茵[18]等得出向培养基中添加PPO抑制剂柠檬酸300mg·L﹣1和硫代硫酸钠100～200mg·L﹣1时，蝴蝶兰外植体的褐变程度得到降低，并发现用50mg·L﹣1抗坏血酸和100mg·L﹣1硫代硫酸钠浸泡外植体10min，培养6d后，外植体褐变率分别降到了73.08%、85.71%。刘真华[19]等研究了抗氧化剂（柠檬酸、半胱氨酸、谷胱甘肽、维生素C和硫代硫酸钠）和吸附剂（活性炭、聚乙烯吡咯烷酮）对蝴蝶兰组培褐变的影响，结果表明活性炭能有效控制褐变和促进生长，但不利于分化；谷胱甘肽控制褐变的效果虽不及活性炭，但综合效果最佳。余慧琳[11]等比较了不同添加剂对花梗腋芽萌发是否褐变的影响，发现柠檬酸、PVP效果比活性炭显著。分析认为，主要是由于活性炭在吸附醌类物质的同时也吸附了分裂素、生长素、维生素等相关成分，从而在抑制组培褐化的同时也影响到了芽的萌发和增殖。
赖艳艳[20]等用100mg·L﹣1柠檬酸共培养和50mg·L﹣1抗坏血酸浸泡处理叶片外植体，离体培养3d时褐变率分别比对照降低了94.9%和54.9%，离体培养6d时褐变指数低于对照的0.53分别为0.46和0.36，PPO活性降低。培养基中加入10%椰子水也能减少原球茎增值过程中的褐變。
3.4.2 采用热激处理
热激反应在活的生物体中普遍存在，当植物置于超过其正常生长温度10～15℃的环境中数个小时，体内就会被诱导合成一种特殊蛋白——热激蛋白。Saltveit[21]等指出，诱导合成的热激蛋白可通过抑制PAL蛋白的翻译，或促进PAL蛋白的代谢等途径使PAL蛋白的积累减少，进而降低了组培褐变的程度。如酒立君[22]等将蝴蝶兰红花系“内山姑娘”的叶片于40℃先热激处理9min，恢复48h后再切割接种，事后发现热激处理后的叶片组培时褐变指数、总酚含量以及PAL活性均显著低于对照组，且3者的两两之间均存在极显著的正相关关系。赵滢[23]以蝴蝶兰B3组培苗为实验材料，得出经热激处理的蝴蝶兰叶片外植体组培褐变程度明显减轻，总酚含量、PAL及PPO活性降低，还发现抗氧化酶（超氧化物歧化酶和抗坏血酸过氧化物酶）活性在热激处理后的短时间内提高了，并造成了丙二醛和过氧化氢生成量的减少，由此保护了细胞膜结构的完整性。综上看出，两者都有力地证明了短时间的热激处理可降低酚合成酶PAL和PPO的活性，阻止了酚类化合物的大量积累，最终降低组培褐变的概率。
3.4.3 连续转移外植体
在组织培养过程中，经常进行细胞筛选，连续转移外植体可有效减轻褐变的概率。因为通过这种不断地更换新鲜培养基的方式，不仅避免了酚类物质的积累，而且还能使植体较快的分生，从而提高外植体分化率和组培成功率。如姚丽娟[24]等采取适时切除培养物的褐化部分，接种后10～15d转1次新培养基的方法，就使蝴蝶兰组培褐化的概率下降了40%。尤海波[12]等经过一系列研究得出，最佳外殖体为带腋芽的、抽4节的花梗，其诱导率最高90.2%，褐化系数最低9.8%；合适消毒方法为表面活性剂（Tweens20）20×10-6处理10min、70%酒精浸泡30s、0.5%的次氯酸钠溶液浸泡5min；适宜添加剂及浓度为10mg·L﹣1抗坏血酸和1000mg·L﹣1聚乙烯吡咯烷酮；最好培养方法为先低温（17～20℃）处理3～5d，再正常温度培养，pH调至5.6。
4 展 望
蝴蝶兰繁殖过程中发生褐变难以避免，但是只要能够采用相应的措施，还是能在一定程度上大幅减少褐变发生的概率。现有研究结果说明，伤害信号分子也可能参与了褐变反应，但伤害信号的确切特性以及其如何将物理伤害转变成生理反应的目前尚未研究清楚，这为蝴蝶兰组培褐变的深入研究提供了一条新的途径。
参考文献
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作者简介：汪金萍（1981-），女，汉族，河南潢川，硕士研究生，讲师，研究方向：农作物育种。
关键词：蝴蝶兰；组培；褐变
中图分类号：S682.31 文献标识码：A
蝴蝶兰素有“洋兰王后”之美称，深受消费者的追捧，经济价值极高。但因其为单轴型兰花，一生只产生1条主茎和1个生长点，常规的分株方式繁殖难以进行，因此蝴蝶兰种苗的大规模生产繁殖常采用组织培养、无菌播种的方法。可是无论是组织培养还是无菌播种，在培育幼苗的过程中都会有褐变现象的发生，这在一定程度上影响了培苗的产量和质量。本文系统地综述了蝴蝶兰人工繁殖过程中发生褐变的机理及各种行之有效的控制措施，以期望为广大从事蝴蝶兰繁殖工作者提供帮助。
1 褐变的机理
褐变是指在人工繁殖过程中，蝴蝶兰从自身表面不断向培养基释放褐色物质，最终使培养基变成褐色，反过来毒害自身导致其死亡的一种现象。现在理论上认为褐变现象的发生，是由于人们在建立外植体无菌体系时破坏了切口附近的细胞膜结构，使得原本被质膜分隔在完整组织以及细胞中的酚类化合物外溢与多酚氧化酶（PPO）相遇，2者在有氧条件下于切口表面发生催化反应形成棕褐色的醌类物质和水，而醌类物质在酶的作用下会与蛋白质发生聚合形成黑褐色物质羟醌与黑色素等物质[1]。正是由于这些黑褐色物质的存在，组织中其他酶的活性受到了抑制，从而引起代谢活动紊乱导致组织生长停滞最终死亡。同理，这也说明了为什么正常的蝴蝶兰组织中，底物、氧气、PPO也同时存在但却并不发生褐变的原因。
2 褐变与相关酚类及酶类的关系
由褐变机理可以看出，褐变现象是一个复杂的生理代谢过程，其发生必须具备3个条件即底物、酶和氧。褐变的天然底物是酚类，而催化酚酸类物质合成和氧化的酶则分别是苯丙氨酸解氨酶（PAL）和PPO，氧则是由过氧化物酶（POD）利用切割时释放的H2O2催化产生。因此，褐变与酚类、相关酶类应该有一定的关系。如许传俊[2]等通过观察蝴蝶兰叶外植体褐变后的细胞亚显微结构分析得出，褐变是由于细胞膜系统遭到破坏，酶、酚发生相互作用产生对细胞有毒害物质，最終导致细胞死亡培养失败的。印芳[3]等利用高效液相色谱法对3个褐化的蝴蝶兰品种A1（大白花红心）、B3（迷你型白花黄心）和R4（深红花红心）所含的9种酚酸进行了分析，结果表明：香豆酸对蝴蝶兰褐变有重要影响；绿原酸、邻苯二酚、咖啡酸可能与蝴蝶兰褐变有相关性；苯甲酸对蝴蝶兰褐变影响很小或没有；PAL和PPO活性与褐变程度呈正相关，POD与褐变有很大关系；总酚含量与PAL活性呈正相关，与PPO和POD活性呈负相关。赵滢[4]等以褐变的蝴蝶兰品种B3、15（迷你型深紫红花圆瓣）和F5（亮黄花淡紫斑纹橘黄唇）为试材，对叶片外植体组培过程中酚类物质代谢及活性氧代谢的相关指标进行了测定，结果表明：总酚含量与PAL、POD活性呈正相关；总酚含量最低的B3褐变程度最严重，PPO活性及丙二醛（MDA）含量始终最高；总酚含量最高的F5褐变程度最轻，PPO活性及丙二醛含量也最低，但F5的超氧化物歧化酶（SOD）和抗坏血酸过氧化物酶（APX）活性在整个培养过程中始终最高。
由上述看出，褐变的发生可能是由于切割伤害造成了活性氧代谢失调，引起膜脂过氧化程度加强，导致细胞膜的完整性被破坏，从而使PPO与酚类物质接触最终酚类物质氧化成醌并聚合而产生褐变。总体来说，蝴蝶兰叶片外植体组培褐变程度与总酚含量有一定相关性，PAL和PPO活性与褐变程度呈正相关，与PPO和POD活性呈负相关，SOD和APX作为抗氧化酶清除了蝴蝶兰组培过程中的活性氧，减轻了膜系统损伤程度。
3 控制蝴蝶兰组培褐变的措施
3.1 外植体的选择
外植体的取材时间、部位、大小及发育阶段都影响着褐变的发生。一般外植体应选择生长旺盛的组织或器官，这样的外植体有很强的分生能力，抵抗褐变的能力强。根尖、茎尖、叶片、花梗芽、花梗节间等器官均可作为蝴蝶兰组培快繁外植体，但各有优劣。如李进进[5]等认为根尖虽不易褐变，但不可较好的分化，相比较茎尖分生较强，容易脱分化并再分化成完整植株组培褐变较轻，其中以0.3cm长的茎尖效果最佳。顾伟民[6]等研究表明，花梗侧芽的成活率最高达75%，花梗成活率62.5%，叶片和根尖最差分别为12.5%和7.5%。外植体的大小会也会影响褐变程度。如杨美纯[7]等研究发现1.0cm×1.0cm的叶块褐变较轻分化也较佳，0.5cm×0.5cm的叶块接种后褐变速度快，培养到第50d时褐变率达100%。外植体越老木质素含量越高越易褐化。如杨海芸[8]等以不同叶龄的叶片为外植体接种发现，取叶龄45d的试管苗为外植体组培褐变最轻，30d次之，60d褐变最重。
对于取材时间，一般选择在早春和秋季进行。因为夏季材料褐变严重，冬季的芽不易生长。如张忠和[9]研究指出，6～8月份高温季节采芽进行组织培养褐变严重，组培成功率很低。还有在切割时，应尽量不要产生较大的伤口面积，并注意减少其与空气接触的时间。如Bonga[10]认为外植体越小，切面与体积的比率越大，伤害及褐变的程度就越大。
3.2 培养条件光照、温度和pH的选择
由于参与褐变发生的酶系统活性受光照和温度的影响，因此为减轻褐变外植体材料接种后在培养初期应保持低温（0～15℃），黑暗或弱光下条件下。如余慧琳[11]等研究表明，把花梗节段或是花梗腋芽的外植体先在黑暗环境中培养1周，再转入光强2000lx下正常培养，结果发现它们都比直接放在2000lx条件下培养的褐变轻，并且褐变发生的时间也得到了推迟。尤海波[12]等分别采用暗培养、30lx光照、1200lx光照，7d后调查发现褐化率随着光照强度的增加而增加。赵伶俐[13]等利用不同温度的对蝴蝶兰外植体进行处理，实验发现接种12d后，20℃褐化颜色最浅，25℃褐化较重褐化部分大部分只集中在切口附近，30℃褐化最多达到70%，褐色最深且已经扩散至整个培养基，从而说明外植体褐化率高低与温度高低成正比。 就pH而言，中性偏酸的培养基有利于降低褐化率。如赵伶俐[13]等研究发现pH5.0褐化率最高水平，褐化率达到32.2%；pH6.5的褐化率最轻，仅为4.4%；pH5.0、5.5、6.0的3种培养基，褐化开始时褐色物质就扩散至整个培养基，pH6.5和7.0中主要集中在外植体边缘褐化且色深。尤海波[12]等将培养基的pH分别设定分为5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8，接种7d后调查褐化率，30d后调查诱导率，通过综合分析不同pH下的褐化率和诱导率，发现培养基设为pH5.6的蝴蝶兰褐化较轻诱导率较高。
3.3 培养基的选择
培养基中添加的激素、金属离子以及不同的培养基形态都会对褐变是否发生及发生程度产生影响。如杨海芸[8]研究发现，添加TDZ的基础培养基与添加6-BA相比外植体褐变较少，培养2个月后外植体仍能保持鲜绿色。李冬杰[14]等研究发现添加6-BA过多会使组织严重褐化。印芳[15]等研究了Fe、K、Ca、Zn、Cu等矿质元素不同浓度对蝴蝶兰组培褐变发生概率的影响，结果表明培养基中随着K、Ca、Zn浓度的升高褐变减轻，而随着Fe、Cu浓度的升高褐化加重。
许传俊[16]等分别利用了纸桥培养基和固体培养基培养蝴蝶兰叶片外植体，对比褐变情况发现，MS纸桥培养基培养的外植体褐变较固体培养基MS、B5、N6的轻。陈菁婴[17]等认为培养叶片最好使用液体培养基，因为这样有毒物质可以很快扩散，从而减少对组织的毒害减轻褐变。
3.4 其他因素
3.4.1 使用抗褐变剂
利用抗氧化剂、抑制剂、吸附剂、椰子汁等物质也可抑制蝴蝶兰组培外植体的褐变。如陈冬茵[18]等得出向培养基中添加PPO抑制剂柠檬酸300mg·L﹣1和硫代硫酸钠100～200mg·L﹣1时，蝴蝶兰外植体的褐变程度得到降低，并发现用50mg·L﹣1抗坏血酸和100mg·L﹣1硫代硫酸钠浸泡外植体10min，培养6d后，外植体褐变率分别降到了73.08%、85.71%。刘真华[19]等研究了抗氧化剂（柠檬酸、半胱氨酸、谷胱甘肽、维生素C和硫代硫酸钠）和吸附剂（活性炭、聚乙烯吡咯烷酮）对蝴蝶兰组培褐变的影响，结果表明活性炭能有效控制褐变和促进生长，但不利于分化；谷胱甘肽控制褐变的效果虽不及活性炭，但综合效果最佳。余慧琳[11]等比较了不同添加剂对花梗腋芽萌发是否褐变的影响，发现柠檬酸、PVP效果比活性炭显著。分析认为，主要是由于活性炭在吸附醌类物质的同时也吸附了分裂素、生长素、维生素等相关成分，从而在抑制组培褐化的同时也影响到了芽的萌发和增殖。
赖艳艳[20]等用100mg·L﹣1柠檬酸共培养和50mg·L﹣1抗坏血酸浸泡处理叶片外植体，离体培养3d时褐变率分别比对照降低了94.9%和54.9%，离体培养6d时褐变指数低于对照的0.53分别为0.46和0.36，PPO活性降低。培养基中加入10%椰子水也能减少原球茎增值过程中的褐變。
3.4.2 采用热激处理
热激反应在活的生物体中普遍存在，当植物置于超过其正常生长温度10～15℃的环境中数个小时，体内就会被诱导合成一种特殊蛋白——热激蛋白。Saltveit[21]等指出，诱导合成的热激蛋白可通过抑制PAL蛋白的翻译，或促进PAL蛋白的代谢等途径使PAL蛋白的积累减少，进而降低了组培褐变的程度。如酒立君[22]等将蝴蝶兰红花系“内山姑娘”的叶片于40℃先热激处理9min，恢复48h后再切割接种，事后发现热激处理后的叶片组培时褐变指数、总酚含量以及PAL活性均显著低于对照组，且3者的两两之间均存在极显著的正相关关系。赵滢[23]以蝴蝶兰B3组培苗为实验材料，得出经热激处理的蝴蝶兰叶片外植体组培褐变程度明显减轻，总酚含量、PAL及PPO活性降低，还发现抗氧化酶（超氧化物歧化酶和抗坏血酸过氧化物酶）活性在热激处理后的短时间内提高了，并造成了丙二醛和过氧化氢生成量的减少，由此保护了细胞膜结构的完整性。综上看出，两者都有力地证明了短时间的热激处理可降低酚合成酶PAL和PPO的活性，阻止了酚类化合物的大量积累，最终降低组培褐变的概率。
3.4.3 连续转移外植体
在组织培养过程中，经常进行细胞筛选，连续转移外植体可有效减轻褐变的概率。因为通过这种不断地更换新鲜培养基的方式，不仅避免了酚类物质的积累，而且还能使植体较快的分生，从而提高外植体分化率和组培成功率。如姚丽娟[24]等采取适时切除培养物的褐化部分，接种后10～15d转1次新培养基的方法，就使蝴蝶兰组培褐化的概率下降了40%。尤海波[12]等经过一系列研究得出，最佳外殖体为带腋芽的、抽4节的花梗，其诱导率最高90.2%，褐化系数最低9.8%；合适消毒方法为表面活性剂（Tweens20）20×10-6处理10min、70%酒精浸泡30s、0.5%的次氯酸钠溶液浸泡5min；适宜添加剂及浓度为10mg·L﹣1抗坏血酸和1000mg·L﹣1聚乙烯吡咯烷酮；最好培养方法为先低温（17～20℃）处理3～5d，再正常温度培养，pH调至5.6。
4 展 望
蝴蝶兰繁殖过程中发生褐变难以避免，但是只要能够采用相应的措施，还是能在一定程度上大幅减少褐变发生的概率。现有研究结果说明，伤害信号分子也可能参与了褐变反应，但伤害信号的确切特性以及其如何将物理伤害转变成生理反应的目前尚未研究清楚，这为蝴蝶兰组培褐变的深入研究提供了一条新的途径。
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作者简介：汪金萍（1981-），女，汉族，河南潢川，硕士研究生，讲师，研究方向：农作物育种。