【摘 要】
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为建立岩原鲤基于环境DNA（eDNA）的实时荧光定量PCR（qPCR）检测方法，准确鉴别岩原鲤并探讨eDNA浓度与其生物量的定量关系，本研究根据岩原鲤mtDNA中12SrRNA基因序列设计eDNA引物和TaqMan探针，利用PCR扩增出岩原鲤12SrRNA基因的序列，克隆入 pMD19-T载体，构建重组质粒作为qPCR标准；使用梯度稀释质粒标准品作为模板，进行 qPCR扩增，制作标准曲线，建立岩原
【机 构】
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西南大学水产学院淡水鱼类资源与生殖发育教育部重点实验室
【基金项目】
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National Natural Science Foundation of China （32071651）； Chongqing Municipal Natural Science Foundation （cstc2020jcyj-msxmX0438）； Science and Technology Innovatio
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为建立岩原鲤基于环境DNA（eDNA）的实时荧光定量PCR（qPCR）检测方法，准确鉴别岩原鲤并探讨eDNA浓度与其生物量的定量关系，本研究根据岩原鲤mtDNA中12SrRNA基因序列设计eDNA引物和TaqMan探针，利用PCR扩增出岩原鲤12SrRNA基因的序列，克隆入 pMD19-T载体，构建重组质粒作为qPCR标准；使用梯度稀释质粒标准品作为模板，进行 qPCR扩增，制作标准曲线，建立岩原鲤qPCR检测方法，并评价其特异性、灵敏性和应用效果。结果显示，引物和TaqMan探针对供试的岩原鲤样品出现荧光增长曲线，显示阳性扩增，而其他鱼类和空白对照均未得到扩增信号，表现为阴性；qPCR的阈值循环数(Ct)与标准品拷贝数的线性关系好，且线性范围广，获得的标准曲线相关系数(R2)达到0.999，检测限位DNA浓度为5×10-6ng/μL，扩增效率为94.7%；检测养殖不同数量岩原鲤的水体中eDNA浓度，目标DNA浓度和岩原鲤数量有R2为0.957的线性正相关性，得到岩原鲤DNA浓度与其个体数量的相关性曲线：y=131 546x+77 623；去除岩原鲤后，eDNA的拷贝数与时间负相关，其在水体环境中的存留时间为17天左右。在本研究中，该岩原鲤eDNA引物和TaqMan探针既能应用于水体中岩原鲤的定性检测上，特异性高、时效性好；又能定量检测出环境中岩原鲤的密度，有利于反映出岩原鲤在不同样点的生物量及时空动态，从而为评价岩原鲤人工放流效果和管理保护资源提供参考。
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